荧光定量PCR的分类（荧光化学分类）

实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。

n①SYBR Green I法：SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，最大吸收波长约为 497 nm，发射波长最大约为 520 nm，可以和所有的 dsDNA 双螺旋小沟区域结合。因为在游离状态下 SYBR Green I 发出的荧光较弱，但是当它与双链 DNA 结合后，荧光就会大大增强，而且荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的扩增完全同步。其优点是对模板没有选择性，使用方便，非常方便，可以监测任何 dsDNA 序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也易与非特异性双链DNA结合，也正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法。因为非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物的低，所以可以在熔解曲线反应过程中利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别。

n②TaqMan探针法：TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量 PCR 技术。它的工作原理是在 PCR 反应体系中存在一对 PCR 引物和一条探针，探针的5′ 端标记有报告基团，3′ 端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代表了模板 DNA 的拷贝数。 目前在Real-time Q-PCR中最广泛使用的Tagman系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5'-3'活性所降解，探针的5'端有一荧光报告基团，3'端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5'端得报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获，针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3'端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。