荧光定量PCR的注意事项

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一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10-500ng，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

n1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

n2、使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。 每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样

n3、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。

操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。nMasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。 每个样品至少3个平行孔，减少加样误差，最好能在冰上操作。 所有成分加完后，离心去除气泡。nPCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 模板尽量避免含有酶抑制剂。 引物保存时间不易过长，要符合引物涉及的原则，在用软件设计结束后要进行适当的人工处理。引物浓度要合适，太高容易引起错配及非特异性产物的形成。 一般退火温度应低于Tm值5℃，先循环数次，然后延伸几分钟，再进行循环，有时候可以加大产物的量 酶浓度不易过高，过高容易导致非特异性产物的形成。 离子浓度不宜过高，过高容易导致非特异性产物的增加。ndNTP不易过多，浓度过高会抑制酶的活性，引起错配。 有些PCR仪器不是很稳定，建议梯度或者后继试验的时候，尽量将PCR管放在仪器的中间部分，同时仪器的四个角落可以放装满水的PCR管，这样可以使仪器温度相对稳定些。 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。

配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。