影响实时荧光定量PCR试验结果的因素

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从DNA出发进行定量相对比较简单，一般在保证引物及探针的特异性、PCR反应体系的合理性以及DNA模板的纯度和完整性的情况下，可以保证试验的顺利进行。从RNA出发对mRNA进行定量时，操作比较复杂，影响试验结果的因素也比较多。

n1、RNA的完整性

因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。

所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。

n2、 RNA样品中的基因组DNA污染

提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA，基因组DNA对试验有两个影响:一是影响对RNA的精确定量;二是影响PCR扩增的特异性。

n3、 PCR反应体系的优化

PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒，可以方便PCR反应的操作。

n4、反转录

反转录所得CDNA的量必须精确地等于相应的 mRNA的量，反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2种: AMV-RT和MMLV-R，反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。相比之下Olig-dT和特异性引物更适合实时定量。

n5、利用实时定量PCR研究基因表达时，一般用相对定量的方法

相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有β-tublin， actin.GAPDH， 18sRNA，efla和Cyclophilin等，尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定，但是最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合任何试验。在选择内标基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内标基因或内标基因组合。