核酸定量基本方法

nnnnn核酸定量基本方法nnnnnnnnnnnn1、定磷法nnnnnnn

核糖核酸（RNA）含磷量约为9.5%，脱氧核糖核酸（DNA）含磷量约为9.2%，采用定磷法可准确测出磷含量，进而折算出样品中核酸含量。

n\\原理：\\在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当还原剂存在时磷钼酸立即转变为蓝色的还原产物——钼蓝；钼蓝最大的刚吸收在650-660nm波长处，根据吸光值制作标准曲线，从而确定核酸的浓度。测定范围在1-10μg

n\\优缺点：\\简单、快速；但易受蛋白与核苷酸的影响。

nnnnnnn2、定糖法nnnnnnn\\\\

n\\原理：\\核糖中的戊糖可在浓盐酸或者浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或者分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定的浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。

n\\RNA浓度的测试：\\RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应形成绿色复合物，生成的绿色化合物在670nm处有最大的吸收值。测定范围在20\~250μg

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n\\DNA浓度的测定：\\脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，生成的蓝色的化合物在595nm处有最大吸收值。测定范围在20\~250 μg

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n\\优缺点：\\较灵敏，但特异性较差

nnnnnnn\\3、紫外吸收法（分光光度法、Nanodrop）\\nnnnnnn

组成核酸分子的碱基，由于含有芳香环结构，具有紫外吸收的特性。吸收值在波长250-270nm之间，最大吸收波长是260nm。一般1μg/ml RNA溶液在1cm光径比色皿中的光吸收峰值约为0.022，1μg/ml DNA溶液的光吸收值为0.020。因此测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。

n\\优缺点：\\操作简便，迅速，只试用于测定浓度大于0.25ng/ul，无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质

nnnnnnn4、荧光光度法nnnnnnn

专门配套的荧光检测技术，只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，可以对DNA和RNA进行精准定量。

n\\优缺点：\\灵敏，简便；价格昂贵

nnnnnnn5、 qPCR法nnnnnnn

使用荧光定量方法中的绝对定量，配套标准品，制作对应的标准曲线，使用荧光定量仪，计算对应的荧光值并转换对应的核酸浓度。

n\\优缺点：\\灵敏度高，误差小；操作时间长

nnnnnnnnnn知识汇总nnnnnnnnnn

随着技术的不断更新与发展，核酸检测越来越趋向于简便的操作、较高的灵敏度、极高的准确性。

紫外吸收法是目前实验室使用最多的核酸检测方法同时也是目前核酸检测最快速的方法，代表仪器：Nanodrop，特点是操作简单，迅速，可以在2-3min出结果；

荧光光度法是目前包括高灵敏度和快速检测的\\首选方法，\\代表仪器：Qubit，准确度较高，可在5min之内出结果；

nqPCR法是目前灵敏度最高的核酸检测方法，主要用于较低的核酸浓度检测。

nnnnnn方法

nnn定糖法

nnn定磷法

nnn紫外吸收法

nnn荧光光度法

nnnqPCR法

nnnnn原理

醛类化合物颜色反应

磷含量折算

芳香环结构的紫外吸收

特异性染料结合

荧光定量

nnnnn检测

分光光度计

分光光度计/Qubit

荧光定量仪

nnnnn灵敏度

nnn1-10μg

nnn20\~250μg（RNA）

n20\~400μg（DNA）

大于0.25ng/ul

nnn0.2-100ng

低至fg级别

nnnnn优点

简单，高浓度核酸检测

操作简便，迅速

灵敏度较高

灵敏度高，适合批量检测

nnnnn缺点

易受蛋白与核苷酸的影响

特异性差

特异性较差

价格昂贵

操作时间长

nnnnn应用

高浓度核酸检测

常规核酸浓度检测

低浓度核酸检测

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