于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。 n2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 n2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。 n2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10mln培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。 nn

RAW264.7细胞株的Cell Culture

nn一、RAW264.7细胞培养的特点

nn1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。

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n n n nnnnn n Normaln 0n n n n 7.8 磅n 0n 2n n falsen falsen falsen n EN-USn ZH-CNn X-NONEn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nnnnnnn /\ Style Definitions \/n table.MsoNormalTablen {mso-style-name:普通表格;n mso-tstyle-rowband-size:0;n mso-tstyle-colband-size:0;n mso-style-noshow:yes;n mso-style-priority:99;n mso-style-parent:"";n mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;n mso-para-margin:0cm;n mso-para-margin-bottom:.0001pt;n mso-pagination:widow-orphan;n font-size:10.5pt;n mso-bidi-font-size:11.0pt;n font-family:"Calibri","sans-serif";n mso-ascii-font-family:Calibri;n mso-ascii-theme-font:minor-latin;n mso-hansi-font-family:Calibri;n mso-hansi-theme-font:minor-latin;n mso-bidi-font-family:"Times New Roman";n mso-bidi-theme-font:minor-bidi;n mso-font-kerning:1.0pt;}nnnnnnnn2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

nn3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

nn4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。

nn5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。

nn*二、RAW264.7\\\\细胞传代*

nn1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)

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n n n nnnnn n Normaln 0n n n n 7.8 磅n 0n 2n n falsen falsen falsen n EN-USn ZH-CNn X-NONEn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nnnnnnn /\ Style Definitions \/n table.MsoNormalTablen {mso-style-name:普通表格;n mso-tstyle-rowband-size:0;n mso-tstyle-colband-size:0;n mso-style-noshow:yes;n mso-style-priority:99;n mso-style-parent:"";n mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;n mso-para-margin:0cm;n mso-para-margin-bottom:.0001pt;n mso-pagination:widow-orphan;n font-size:10.5pt;n mso-bidi-font-size:11.0pt;n font-family:"Calibri","sans-serif";n mso-ascii-font-family:Calibri;n mso-ascii-theme-font:minor-latin;n mso-hansi-font-family:Calibri;n mso-hansi-theme-font:minor-latin;n mso-bidi-font-family:"Times New Roman";n mso-bidi-theme-font:minor-bidi;n mso-font-kerning:1.0pt;}nnnnnnnn2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml， 37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。（值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感）

nn3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小

nn4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶

三、RAW264.7细胞冻存及复苏\\\\\\

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nn1. 配制冻存培养液；（通用的为培养基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可进行调整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例过高）

nn2. 取对数生长期的细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；

nn3. 离心1000rpm，5min；

nn4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

nn5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml（不超过冻存管容量的80%）；

nn6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

nn7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（具体操作为4°C 20min，-20°C30min，-70℃过夜，转入液氮中）

nn（二）细胞复苏

nn1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。（1min以内溶解完毕，不能将口进入水面下）

nn2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

nn3. 离心， 1000rpm，5min；

nn4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；(复苏时细胞密度稍大，可提高复苏效率)

nn5. 次日更换一次培养液，继续培养。（可更换一半培养液，避免跨度太大，影响细胞状态）

nn（三）接种

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n n n nnnnn n Normaln 0n n n n 7.8 磅n 0n 2n n falsen falsen falsen n EN-USn ZH-CNn X-NONEn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nnnnnnn /\ Style Definitions /n table.MsoNormalTablen {mso-style-name:普通表格;n mso-tstyle-rowband-size:0;n mso-tstyle-colband-size:0;n mso-style-noshow:yes;n mso-style-priority:99;n mso-style-parent:"";n mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;n mso-para-margin:0cm;n mso-para-margin-bottom:.0001pt;n mso-pagination:widow-orphan;n font-size:10.5pt;n mso-bidi-font-size:11.0pt;n font-family:"Calibri","sans-serif";n mso-ascii-font-family:Calibri;n mso-ascii-theme-font:minor-latin;n mso-hansi-font-family:Calibri;n mso-hansi-theme-font:minor-latin;n mso-bidi-font-family:"Times New Roman";n mso-bidi-theme-font:minor-bidi;n mso-font-kerning:1.0pt;}nnnnnnnn\\四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法\\\

nn1.倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。 n 2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为"二传"。

nn3.如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。

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五、RAW264.7培养经验

nn1，基本情况: 小鼠来源白血病毒诱导肿瘤细胞，属于巨噬细胞，贴壁生长。下图是ATCC来源。虽说ATCC权威，但是园子里面主流观点是以椭圆圆形细胞为主，激活分化后才有触角。

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n n n nnnnn n Normaln 0n n n n 7.8 磅n 0n 2n n falsen falsen falsen n EN-USn ZH-CNn X-NONEn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nn n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n nnnnnnn /\ Style Definitions \/n table.MsoNormalTablen {mso-style-name:普通表格;n mso-tstyle-rowband-size:0;n mso-tstyle-colband-size:0;n mso-style-noshow:yes;n mso-style-priority:99;n mso-style-parent:"";n mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;n mso-para-margin:0cm;n mso-para-margin-bottom:.0001pt;n mso-pagination:widow-orphan;n font-size:10.5pt;n mso-bidi-font-size:11.0pt;n font-family:"Calibri","sans-serif";n mso-ascii-font-family:Calibri;n mso-ascii-theme-font:minor-latin;n mso-hansi-font-family:Calibri;n mso-hansi-theme-font:minor-latin;n mso-bidi-font-family:"Times New Roman";n mso-bidi-theme-font:minor-bidi;n mso-font-kerning:1.0pt;}nnnnnnnnhttps://www.atcc.org/Products/All/TIB-71.aspx#generalinformation

形态以类圆形和不规则为主，一般1～2个核，极少数有3个核，胞浆伸展时胞体较大。镜下细胞为小珍珠似的圆形椭圆形。

nn2，培养情况

培养条件：10%FBS高糖DMEN，进口gibco血清更好

传代：细胞增殖较快，70%即可传代，细胞有触角也提示需要传代，1：3----1:6传代，推荐使用皿。传代时切记不要使用胰酶，正常情况下此细胞贴壁不牢，直接吹打即可，胰酶消化会使细胞伸出触角改变形态。我是直接用培养基吹打，也可以用PBS，感觉无差异。

冻存和复苏：和普通细胞无异。

RAW264.7作为巨噬细胞有很强的吞噬能力，吞噬抗原后伸出长角，就是大家常见的伪足。同时贴壁黏附能力增强，传代时难以消化下来。

该细胞贴壁时间短，成片生长，似小菌落般小片生长，最后连,成一片并会叠层。传代密度不易过高或者过低，过低会导致细胞生长缓慢甚至不生长，过高，细胞会长出伪足。

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正常细胞为贴壁不牢的圆形椭圆形细胞，分化后伸出伪足，贴壁能力增强。

避免方法，

nn1、血清最好是进口的真血清

nn2、密度不要太高或者太低，由其是需要传代时切不可拖延时间

nn3、传代时切不可胰酶消化，直接吹打就能下来

4、不要污染，包括其他细胞株的污染

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