3xTg-AD 转基因模型

重复训练后移除平台进行探测，比较训练过程中的学习曲线及探测试验的目标象限偏好。

每日从 N、S、E、W 四个方位下水，起始方位在动物和训练日之间随机排列。

实验操作与数据分析对分组设盲。

方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。

在目标脑区观察到 FastBlue 碱性磷酸酶底物形成的蓝色沉积，其分布与 6E10 反应性人源或人源化 Aβ/APP 表位一致；需结合阳性、阴性与内源 IgG 对照判读。该方案不单独区分 Aβ40 与 Aβ42，不把染色强度直接解释为不溶性斑块负荷或绝对浓度；如用于定量，需另建图像采集与分析方案。

训练期逃避潜伏期、路径长度和游泳速度；探测期目标象限停留时间及搜索路径。

灌注前溶液配制 配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。 麻醉诱导 通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。 开胸与左心室插管 打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。 动脉与毛细血管系统标记 如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。 预洗液灌注冲洗 以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。 固定液灌注 灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。 组织采集与后固定 解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。 PBS漂洗 用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。 保存 置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。

石蜡切片准备 在 2–3 µm 厚石蜡切片上进行免疫组织化学染色。 去除多余石蜡 56° 下去除多余石蜡 1h–24h。 复水 复水。 二甲苯脱蜡 二甲苯 4 次，每次 5 min。 异丙醇:二甲苯过渡 异丙醇:二甲苯 1:1 处理 1 次，3 min。 100% 异丙醇 100% 异丙醇处理 2 次，每次 3 min。 90% 异丙醇 90% 异丙醇处理 1 次，3 min。 70% 异丙醇 70% 异丙醇处理 1 次，3 min。 50% 异丙醇 50% 异丙醇处理 1 次，3 min。 蒸馏水洗涤 用蒸馏水洗涤 3 次。 抗原修复 进行抗原修复。 柠檬酸缓冲液热修复 用 1× 柠檬酸缓冲液（10 mM，pH 6）加热修复，蒸汽处理 30 min。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 甲酸处理 室温下用 98% 甲酸处理 1 min，用于 β-淀粉样蛋白免疫组织化学。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 过氧化氢封闭 室温下用含 3% 过氧化氢的 TBS 处理 10 min。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 正常山羊血清封闭 室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 封闭 10 min。 倾去封闭液 倾去含 10% 正常山羊血清的 TBS，不洗涤，直接进入下一步。 一抗孵育 在湿盒中于室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 孵育一抗过夜。一抗为 6E10（Zytomed Systems GmbH，货号 Z 932002-Y），靶标人 β-淀粉样蛋白，小鼠宿主，按 1:500 稀释。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 碱性磷酸酶二抗孵育 在湿盒中于室温下孵育碱性磷酸酶偶联二抗 2 h，二抗按 1:100 稀释；二抗为 Jackson ImmunoResearch 115-055-003，山羊抗小鼠 IgG。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 FastBlue 显色 用 FastBlue 显色 30–60 min：49 mL TBS（pH 7.5）、1 mL Naphtol AS Mix Phosphat、50 µL Levamisol、25 mg FastBlue，混匀后过滤。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 苏木素复染 苏木素复染 10 s。 流水冲洗 自来水冲洗 10 min。 Aquatex 封片 用 Aquatex 封片。

训练试次 每天从 N、S、E、W 四个象限边缘的 4 个不同起始位置释放每只小鼠。每次给予至多 100 s 寻找隐蔽平台；到达平台后停留 15 s。若小鼠在 100 s 内未找到平台，引导其到平台并停留 15 s。试次间将小鼠放回铺有干燥垫料的暂养笼，间隔 15–30 min。动物之间及不同训练日的起始位置应随机排列，避免形成固定位置策略。 无平台探测试次 每个工作周结束时移除隐蔽平台，从原平台相对象限释放小鼠，自由游泳 100 s。使用 EthoVision 记录搜索路径。对目标象限的偏好反映空间记忆巩固。 数据分析 使用 EthoVision 自动计算路径长度（cm）、游泳速度（cm/s）及各区域或象限停留时间。分析训练日之间的逃避潜伏期和路径长度，形成学习曲线；探测试验比较目标象限与其他象限的停留时间，并采用适合研究设计的统计检验。WT 小鼠的逃避潜伏期应随训练逐渐下降，探测试验对目标象限的偏好应达到 >25% 停留时间。KO 小鼠若存在空间学习障碍，可表现为逃避潜伏期延长或缺少象限偏好。