Tg2576 转基因淀粉样蛋白模型（APP695 Swedish）

比较野生型-载体、野生型-NRG1、Tg2576-载体、Tg2576-NRG1四组海马切片中的PSD95免疫反应性。

重复训练后移除平台进行探测，比较训练过程中的学习曲线及探测试验的目标象限偏好。

每日从 N、S、E、W 四个方位下水，起始方位在动物和训练日之间随机排列。

实验操作与数据分析对分组设盲。

海马切片中PSD95免疫反应性及其空间分布，以DAPI标记的细胞核作为定位参照。

在目标脑区观察到 FastBlue 碱性磷酸酶底物形成的蓝色沉积，其分布与 6E10 反应性人源或人源化 Aβ/APP 表位一致；需结合阳性、阴性与内源 IgG 对照判读。该方案不单独区分 Aβ40 与 Aβ42，不把染色强度直接解释为不溶性斑块负荷或绝对浓度；如用于定量，需另建图像采集与分析方案。

训练期逃避潜伏期、路径长度和游泳速度；探测期目标象限停留时间及搜索路径。

切片准备 使用已制备的固定小鼠游离脑组织切片。 切片洗涤 使用含0.2% Triton X-100的1× TBS（TBST）洗涤脑切片。 封闭 进行非特异性结合封闭。 血清封闭 将切片置于TBST配制的10%正常山羊血清中，室温孵育1 h。 一抗孵育 使用PSD95兔源一抗进行免疫标记。 一抗结合 以10%正常山羊血清/TBST稀释一抗，4°C轻轻振荡孵育2–3夜。 PSD95一抗 PSD95兔源抗体，货号51-6900，稀释比例1:300。 二抗孵育 使用与兔源一抗匹配的Alexa Fluor偶联二抗。 一抗后洗涤 使用TBST洗涤切片。 荧光二抗结合 将Alexa Fluor偶联二抗以1:200稀释于TBST，室温孵育2–3 h。 封片 完成免疫标记后进行封片。 封片前洗涤 使用TBST洗涤切片。 封片介质 使用90%甘油、20 mM Tris（pH 8.0）和0.5%正丙基没食子酸酯配制的封片介质，将切片封于载玻片上。 盖玻片封固 使用指甲油封固盖玻片边缘。 细胞核标记 使用DAPI进行细胞核染色。 DAPI核染 在二抗孵育的最后10 min，将DAPI以1:50,000加入二抗孵育液。 荧光成像 记录免疫标记与细胞核染色的荧光图像。 图像采集 使用荧光显微镜采集图像，例如Olympus FV 3000。

石蜡切片准备 在 2–3 µm 厚石蜡切片上进行免疫组织化学染色。 去除多余石蜡 56° 下去除多余石蜡 1h–24h。 复水 复水。 二甲苯脱蜡 二甲苯 4 次，每次 5 min。 异丙醇:二甲苯过渡 异丙醇:二甲苯 1:1 处理 1 次，3 min。 100% 异丙醇 100% 异丙醇处理 2 次，每次 3 min。 90% 异丙醇 90% 异丙醇处理 1 次，3 min。 70% 异丙醇 70% 异丙醇处理 1 次，3 min。 50% 异丙醇 50% 异丙醇处理 1 次，3 min。 蒸馏水洗涤 用蒸馏水洗涤 3 次。 抗原修复 进行抗原修复。 柠檬酸缓冲液热修复 用 1× 柠檬酸缓冲液（10 mM，pH 6）加热修复，蒸汽处理 30 min。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 甲酸处理 室温下用 98% 甲酸处理 1 min，用于 β-淀粉样蛋白免疫组织化学。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 过氧化氢封闭 室温下用含 3% 过氧化氢的 TBS 处理 10 min。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 正常山羊血清封闭 室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 封闭 10 min。 倾去封闭液 倾去含 10% 正常山羊血清的 TBS，不洗涤，直接进入下一步。 一抗孵育 在湿盒中于室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 孵育一抗过夜。一抗为 6E10（Zytomed Systems GmbH，货号 Z 932002-Y），靶标人 β-淀粉样蛋白，小鼠宿主，按 1:500 稀释。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 碱性磷酸酶二抗孵育 在湿盒中于室温下孵育碱性磷酸酶偶联二抗 2 h，二抗按 1:100 稀释；二抗为 Jackson ImmunoResearch 115-055-003，山羊抗小鼠 IgG。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 FastBlue 显色 用 FastBlue 显色 30–60 min：49 mL TBS（pH 7.5）、1 mL Naphtol AS Mix Phosphat、50 µL Levamisol、25 mg FastBlue，混匀后过滤。 TBS 洗涤 用 TBS 洗涤 3 次。 苏木素复染 苏木素复染 10 s。 流水冲洗 自来水冲洗 10 min。 Aquatex 封片 用 Aquatex 封片。

训练试次 每天从 N、S、E、W 四个象限边缘的 4 个不同起始位置释放每只小鼠。每次给予至多 100 s 寻找隐蔽平台；到达平台后停留 15 s。若小鼠在 100 s 内未找到平台，引导其到平台并停留 15 s。试次间将小鼠放回铺有干燥垫料的暂养笼，间隔 15–30 min。动物之间及不同训练日的起始位置应随机排列，避免形成固定位置策略。 无平台探测试次 每个工作周结束时移除隐蔽平台，从原平台相对象限释放小鼠，自由游泳 100 s。使用 EthoVision 记录搜索路径。对目标象限的偏好反映空间记忆巩固。 数据分析 使用 EthoVision 自动计算路径长度（cm）、游泳速度（cm/s）及各区域或象限停留时间。分析训练日之间的逃避潜伏期和路径长度，形成学习曲线；探测试验比较目标象限与其他象限的停留时间，并采用适合研究设计的统计检验。WT 小鼠的逃避潜伏期应随训练逐渐下降，探测试验对目标象限的偏好应达到 >25% 停留时间。KO 小鼠若存在空间学习障碍，可表现为逃避潜伏期延长或缺少象限偏好。