C57 小鼠 MCAO 线栓模型

重复训练后移除平台进行探测，比较训练过程中的学习曲线及探测试验的目标象限偏好。

每日从 N、S、E、W 四个方位下水，起始方位在动物和训练日之间随机排列。

实验操作与数据分析对分组设盲。

方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。

存活脑组织染为红色、梗死区呈白色；以 2 mm 连续冠状切片逐孔染色成像后，测量患侧与对侧半球的梗死面积及总面积，计算患侧相对对侧的梗死面积百分比。

训练期逃避潜伏期、路径长度和游泳速度；探测期目标象限停留时间及搜索路径。

灌注前溶液配制 配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。 麻醉诱导 通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。 开胸与左心室插管 打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。 动脉与毛细血管系统标记 如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。 预洗液灌注冲洗 以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。 固定液灌注 灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。 组织采集与后固定 解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。 PBS漂洗 用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。 保存 置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。

TTC Staining TTC Staining The brain is removed from the skull and placed into a brain slicer mold placed in ice. Razor blades are positioned in the mold to obtain 2mm thick sections. Sections are placed in individual wells of a 24 well tissue culture dish with 500 μl of 2% TTC in 0.1M PBS. The plate is wrapped in foil and placed on a 37°C slide warmer for 30 minutes. TTC is removed and 500ul of fixative is added to each well for storage. Images of the sections are captured by Olympus S2H10 research stereo- microscope and Adobe Photoshop software. The infarct area and total area of the contralateral and ipsilateral hemispheres are measured with Scion image software (Scion Corporation). The percent infarct area is calculated as a percentage of the ipsilateral hemisphere relative to the contralateral hemisphere as previously described. [F2.JPG]]()

训练试次 每天从 N、S、E、W 四个象限边缘的 4 个不同起始位置释放每只小鼠。每次给予至多 100 s 寻找隐蔽平台；到达平台后停留 15 s。若小鼠在 100 s 内未找到平台，引导其到平台并停留 15 s。试次间将小鼠放回铺有干燥垫料的暂养笼，间隔 15–30 min。动物之间及不同训练日的起始位置应随机排列，避免形成固定位置策略。 无平台探测试次 每个工作周结束时移除隐蔽平台，从原平台相对象限释放小鼠，自由游泳 100 s。使用 EthoVision 记录搜索路径。对目标象限的偏好反映空间记忆巩固。 数据分析 使用 EthoVision 自动计算路径长度（cm）、游泳速度（cm/s）及各区域或象限停留时间。分析训练日之间的逃避潜伏期和路径长度，形成学习曲线；探测试验比较目标象限与其他象限的停留时间，并采用适合研究设计的统计检验。WT 小鼠的逃避潜伏期应随训练逐渐下降，探测试验对目标象限的偏好应达到 >25% 停留时间。KO 小鼠若存在空间学习障碍，可表现为逃避潜伏期延长或缺少象限偏好。