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实验小鼠心脏灌注固定：解剖学研究组织标本制备

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成年小鼠经腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）麻醉后开胸，经左心室插管依次灌注预洗液与4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定液，流程中包含经左心室注射荧光标记番茄凝集素以在体标记动脉与毛细血管系统的步骤。目标组织采集后于固定液内4°C后固定，经0.1 M PBS（pH 7.2）漂洗后转入含0.1%叠氮钠的PBS于4°C保存，输出形态保存良好的组织，供解剖学观察及免疫组织化学等显微分析使用。实施本方案前须获得相应的动物实验伦理批准。

适用范围与方法

样本：成年小鼠组织（脑、脊髓、神经节及脏器）

细胞与组织固定

试剂与材料 BOM

步骤品名角色用量必需 / 可选可替代条件SKU / 规格文献产品
开胸与左心室插管灌注针及连接管/T形接头用于左心室插管，将预洗液与固定液经T形接头连接至灌注管路。

由灌注针、连接管和T形接头组成；原来源未报告针口径、管径或材质。

来源未报告必需来源未报告可询价来源未报告
动脉与毛细血管系统标记31G 注射针（血管凝集素标记用）在血管标记分支中，将凝集素注入左心室。

针规格为31G；仅对应选择血管标记时的操作，不作为所有灌注的必需材料。

来源未报告可选来源未报告可询价来源未报告
麻醉诱导氯胺酮 (HCl)麻醉诱导

实验动物注射用麻醉剂，按氯胺酮计量给药；来源记录标注Lyppard #KETAI1。

氯胺酮150 mg/kg，腹腔注射必需来源未报告可询价来源未报告
预洗液灌注冲洗灌注预洗液（氯化钠-亚硝酸钠-肝素混合液）灌注前冲洗血液

0.9%氯化钠中临用前加入亚硝酸钠与肝素（5000 IU/mL）；蠕动泵约18 mL/min灌注。

成年小鼠通常约18–20 mL，灌注至流出液清亮、肝与四肢苍白必需来源未报告可询价来源未报告
固定液灌注4%多聚甲醛/0.1 M磷酸缓冲液固定液（pH 7.4）灌注固定

4%多聚甲醛以0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）配制；配制后不超过48小时使用，4°C保存并于灌注日恢复室温。

每只成年小鼠90 mL必需来源未报告可询价来源未报告
PBS漂洗0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）漂洗液固定组织漂洗

PBS浓度0.1 M、pH 7.2（区别于本站既有条目的pH 7.4配方）。

每次浸没漂洗30分钟，共3次必需来源未报告可询价来源未报告
麻醉诱导赛拉嗪 (HCl)麻醉诱导（与氯胺酮联用）

实验动物注射用药，与氯胺酮联用；来源记录标注Lyppard #L10605。

赛拉嗪15 mg/kg，腹腔注射必需来源未报告可询价来源未报告
组织采集与后固定4%多聚甲醛/0.1 M磷酸缓冲液固定液（pH 7.4）采集组织后固定

与灌注固定液同一配方（4%多聚甲醛/0.1 M PB，pH 7.4）。

每例组织浸没于固定液，4°C固定18–24小时必需来源未报告可询价来源未报告
动脉与毛细血管系统标记DyLight 649标记番茄凝集素（Lycopersicon esculentum）在体标记动脉与毛细血管系统

以DyLight 649荧光标记的偶联物，来源记录标注Thermo Fisher Scientific #L32472；仅在需要血管标记时于开胸后立即执行该步骤。

1 mg/mL工作液100 µL，30秒内注入左心室，循环1分钟可选来源未报告可询价来源未报告
保存含0.1%叠氮钠的PBS保存液检测前组织保存

含0.1%叠氮钠；叠氮钠抑制辣根过氧化物酶（HRP），与基于HRP的检测体系不兼容。

组织浸没于保存液，4°C存放必需来源未报告可询价来源未报告
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方案 #183 · 修订 5 灌注针及连接管/T形接头 | 来源未报告 | 可询价 31G 注射针（血管凝集素标记用） | 来源未报告 | 可询价 氯胺酮 (HCl) | 氯胺酮150 mg/kg，腹腔注射 | 可询价 灌注预洗液（氯化钠-亚硝酸钠-肝素混合液） | 成年小鼠通常约18–20 mL，灌注至流出液清亮、肝与四肢苍白 | 可询价 4%多聚甲醛/0.1 M磷酸缓冲液固定液（pH 7.4） | 每只成年小鼠90 mL | 可询价 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）漂洗液 | 每次浸没漂洗30分钟，共3次 | 可询价 赛拉嗪 (HCl) | 赛拉嗪15 mg/kg，腹腔注射 | 可询价 4%多聚甲醛/0.1 M磷酸缓冲液固定液（pH 7.4） | 每例组织浸没于固定液，4°C固定18–24小时 | 可询价 DyLight 649标记番茄凝集素（Lycopersicon esculentum） | 1 mg/mL工作液100 µL，30秒内注入左心室，循环1分钟 | 可询价 含0.1%叠氮钠的PBS保存液 | 组织浸没于保存液，4°C存放 | 可询价

实验流程

  1. 灌注前溶液配制

    配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。

  2. 麻醉诱导

    通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。

  3. 开胸与左心室插管

    打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。

  4. 动脉与毛细血管系统标记

    如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。

  5. 预洗液灌注冲洗

    以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。

  6. 固定液灌注

    灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。

  7. 组织采集与后固定

    解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。

  8. PBS漂洗

    用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。

  9. 保存

    置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。

质量控制与输出

预洗以右心房产出液清亮、肝脏与四肢苍白为完成判据；固定以器官变硬、组织充分保存为完成判据；预洗液临用前配制，固定液使用前配制不超过48小时并4°C保存、灌注当日恢复至室温；含0.1%叠氮钠的保存液与基于辣根过氧化物酶（HRP）的检测体系不兼容（叠氮钠抑制HRP）。

方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。

参考文献

  1. Keast JR, Bowden L, Osborne PB. Intracardiac perfusion of experimental mice with fixative for anatomical studies. protocols.io 记录227096, v1（2026-09-10发布）. DOI:10.17504/protocols.io.bp2l6z7xdgqe · DOI: 10.17504/protocols.io.bp2l6z7xdgqe/v1
  2. Thermo Fisher Scientific, IHC Troubleshooting Guide (Pierce Protein Methods): Sodium azide inhibits HRP（叠氮钠抑制辣根过氧化物酶活性）

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