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小鼠海马切片PSD95免疫荧光检测

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通过PSD95免疫荧光标记观察小鼠海马切片的突触后蛋白分布，并以DAPI标记细胞核。

适用范围与方法

样本：已制备的固定小鼠游离海马脑组织切片

immunohistochemistry

试剂与材料 BOM

步骤品名角色用量必需 / 可选可替代条件SKU / 规格文献产品
封片介质玻璃载玻片（脑切片封片用）承载完成免疫荧光标记的脑切片，供封片与显微观察。

玻璃载玻片；原来源未报告载玻片尺寸、涂层或厂家。

来源未报告必需来源未报告可询价来源未报告
盖玻片封固盖玻片（脑切片封片用）覆盖封片后的脑切片，边缘使用原方案所列指甲油封固。

与载玻片及封片步骤配用的盖玻片；原来源未报告尺寸与厚度。

来源未报告必需来源未报告可询价来源未报告
盖玻片封固盖玻片边缘封固用指甲油盖玻片边缘封固

适用于盖玻片边缘封固的混合物

覆盖盖玻片边缘必需来源未报告可询价来源未报告
切片洗涤TBST 组织切片洗涤液（TBS、0.2% Triton X-100）脑切片洗涤

TBS与Triton X-100混合工作液

1× TBS；0.2% Triton X-100必需来源未报告可询价来源未报告
荧光二抗结合Alexa Fluor 偶联二抗工作液（1:200，PSD95兔源一抗通道）荧光读出

Alexa Fluor偶联二抗，与所选兔源PSD95一抗配对

1:200必需来源未报告可询价来源未报告
封片介质脑切片甘油/Tris/正丙基没食子酸酯封片液切片封片

按来源配方制备的多组分封片介质

90%甘油；20 mM Tris，pH 8.0；0.5%正丙基没食子酸酯必需来源未报告可询价来源未报告
DAPI核染DAPI 核染工作液（1:50000，脑切片免疫荧光）细胞核复染

DAPI核染工作液，与所采用荧光检测体系配合

1:50000必需来源未报告可询价来源未报告
血清封闭10% 正常山羊血清/TBST 封闭与一抗稀释液封闭及一抗稀释

正常山羊血清配制的TBST工作液

10%必需来源未报告可询价来源未报告
PSD95一抗PSD95 兔源抗体（51-6900）PSD95检测一抗

兔IgG多克隆、PSD95靶标，货号51-6900；二抗与兔源一抗配对。

1:300必需来源未报告可询价来源未报告
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方案 #184 · 修订 3 玻璃载玻片（脑切片封片用） | 来源未报告 | 可询价 盖玻片（脑切片封片用） | 来源未报告 | 可询价 盖玻片边缘封固用指甲油 | 覆盖盖玻片边缘 | 可询价 TBST 组织切片洗涤液（TBS、0.2% Triton X-100） | 1× TBS；0.2% Triton X-100 | 可询价 Alexa Fluor 偶联二抗工作液（1:200，PSD95兔源一抗通道） | 1:200 | 可询价 脑切片甘油/Tris/正丙基没食子酸酯封片液 | 90%甘油；20 mM Tris，pH 8.0；0.5%正丙基没食子酸酯 | 可询价 DAPI 核染工作液（1:50000，脑切片免疫荧光） | 1:50000 | 可询价 10% 正常山羊血清/TBST 封闭与一抗稀释液 | 10% | 可询价 PSD95 兔源抗体（51-6900） | 1:300 | 可询价

实验流程

  1. 切片准备

    使用已制备的固定小鼠游离脑组织切片。

  2. 切片洗涤

    使用含0.2% Triton X-100的1× TBS（TBST）洗涤脑切片。

  3. 封闭

    进行非特异性结合封闭。

  4. 血清封闭

    将切片置于TBST配制的10%正常山羊血清中，室温孵育1 h。

  5. 一抗孵育

    使用PSD95兔源一抗进行免疫标记。

  6. 一抗结合

    以10%正常山羊血清/TBST稀释一抗，4°C轻轻振荡孵育2–3夜。

  7. PSD95一抗

    PSD95兔源抗体，货号51-6900，稀释比例1:300。

  8. 二抗孵育

    使用与兔源一抗匹配的Alexa Fluor偶联二抗。

  9. 一抗后洗涤

    使用TBST洗涤切片。

  10. 荧光二抗结合

    将Alexa Fluor偶联二抗以1:200稀释于TBST，室温孵育2–3 h。

  11. 封片

    完成免疫标记后进行封片。

  12. 封片前洗涤

    使用TBST洗涤切片。

  13. 封片介质

    使用90%甘油、20 mM Tris（pH 8.0）和0.5%正丙基没食子酸酯配制的封片介质，将切片封于载玻片上。

  14. 盖玻片封固

    使用指甲油封固盖玻片边缘。

  15. 细胞核标记

    使用DAPI进行细胞核染色。

  16. DAPI核染

    在二抗孵育的最后10 min，将DAPI以1:50,000加入二抗孵育液。

  17. 荧光成像

    记录免疫标记与细胞核染色的荧光图像。

  18. 图像采集

    使用荧光显微镜采集图像，例如Olympus FV 3000。

质量控制与输出

二抗与兔源一抗匹配；分别记录PSD95荧光信号与DAPI核染信号。

海马切片中PSD95免疫反应性及其空间分布，以DAPI标记的细胞核作为定位参照。

研究设计
比较野生型-载体、野生型-NRG1、Tg2576-载体、Tg2576-NRG1四组海马切片中的PSD95免疫反应性。

参考文献

  1. 小鼠海马切片PSD95免疫荧光检测 · DOI: 10.17504/protocols.io.j8nlk8m4xl5r/v2
  2. Ryu J, Hong B-H, Kim Y-J et al. Neuregulin-1 attenuates cognitive function impairments in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. 2016. DOI:10.1038/cddis.2016.30; PMID:26913607. · DOI: 10.1038/cddis.2016.30
  3. Thermo Fisher Scientific / Invitrogen. PSD-95 Polyclonal Antibody, catalog 51-6900, RRID:AB_2533914.

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