大鼠脑组织 Sirt1 转录本定量（cDNA qPCR）

分别扩增 Sirt1 与 GAPDH，以 GAPDH 为内参，比较大鼠脑组织来源 cDNA 中的 Sirt1 相对表达量。

适用范围与方法

样本：大鼠脑组织 RNA 经反转录获得的 cDNA；每孔 10 ng cDNA。

步骤	品名	角色	用量	必需 / 可选	可替代条件	SKU / 规格	文献产品
加入 cDNA	LightCycler 480 384孔反应板（Roche 4729749001）	用于LightCycler 480上的Sirt1与GAPDH qPCR反应。来源指定Roche Diagnostics 4729749001、384孔；这是一手来源中的材料参考，不是本公司可售SKU或供货承诺。	来源未报告	必需	来源未报告	可询价	来源未报告
配制反应预混液	PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776）	SYBR Green 扩增预混液 PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776）。	5 µL/反应孔	必需	来源未报告	可询价	来源未报告
配制反应预混液	大鼠 Sirt1 qPCR 正反向引物对	Sirt1 目标基因引物使用所列大鼠 Sirt1 正反向引物序列；与 GAPDH 反应分开。	Sirt1 反应孔加入 1 µL 正反向引物工作混合液（5 µM）	必需	来源未报告	可询价	来源未报告
配制反应预混液	大鼠 GAPDH qPCR 正反向引物对	GAPDH 内参引物使用所列大鼠 GAPDH 正反向引物序列；与 Sirt1 反应分开。	GAPDH 反应孔加入 1 µL 正反向引物工作混合液（5 µM）	必需	来源未报告	可询价	来源未报告
配制反应预混液	无核酸酶水（Nuclease-free water）	引物稀释用水无核酸酶水，适用于 qPCR。	用于配制 5 µM 引物工作混合液；加水量由引物储备液浓度确定	必需	来源未报告	可询价	来源未报告

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SYBR Green 反应
SYBR Green qPCR。
配制反应预混液
每孔配制 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776，Applied Biosystems–Thermo Fisher）和 1ul 正反向引物工作混合液（用无核酸酶水配至 5 µM）。
分装预混液
使用 Multipette E3 自动移液器，将 6ul SYBR 预混液加入每孔。
加入 cDNA
每孔加入 4ul cDNA（10 ng），置于 LightCycler 480 的 384 孔反应板（Roche，4729749001）；每项检测设置 3 个技术重复。
实时扩增
使用 LightCycler 480：50˚C 2 min；95˚C 2 min；随后 95˚C 15 s、60˚C 1 min，重复 40 个循环。
读取 Ct
使用 LightCycler 软件获取各样品的阈值循环数（Ct）。
表达量分析
使用内参基因和对照实验组，以 ΔΔCt 法分析表达数据。

核对 Sirt1 和 GAPDH 引物序列，分别检查扩增特异性、技术重复一致性及阴性对照。比较组使用一致的样品处理与分析方式；技术重复不计为独立动物数。GAPDH 用作内参前应确认在研究条件下表达稳定。

Sirt1 与 GAPDH 的 Ct 值、ΔCt、相对于对照组的 ΔΔCt，以及 Sirt1 相对表达量（2^−ΔΔCt）。