主动脉 en face 斑块成像与面积定量

适用范围与方法

样本：固定后解剖分离的小鼠主动脉（升主动脉至髂动脉分叉，保留头臂干与左颈总动脉残端）

histopathology assay

• Ldlr⁻⁻ 动脉粥样硬化模型

  年龄

  8 周龄起分组（来源研究分组时点）

  性别

  雄性

  组织

  主动脉

• ApoE⁻⁻ 动脉粥样硬化模型

  年龄

  成年期

  组织

  主动脉

试剂与材料

• 4% 多聚甲醛 (PFA) 固定液
• 10% 中性缓冲福尔马林
• 0.9% 氯化钠溶液（生理盐水）
• 含 0.02% 叠氮钠的生理盐水保存液

实验流程

1. 固定、清洁与剖开

   1. 解剖所得主动脉每支置于 4% 多聚甲醛或 10% 中性缓冲福尔马林中固定 24–48 小时；固定后可存于生理盐水，室温或 2–8 EC 保存。 2. 去除外膜组织以清洁主动脉，注意不撕破或切伤主动脉及无名动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉等重要分支；清洁前先在生理盐水中浸泡数小时有助于清洁，操作全程以生理盐水保持组织湿润。 3. 无名动脉与左颈总动脉各保留 1 mm，左锁骨下动脉自根部完全切除；沿外侧弯经无名动脉、左颈总动脉剪开至左锁骨下动脉处，再沿升主动脉内侧弯向下剪开至腹段底部。

2. 展平固定

   1. 用探针（Fine Science Tools 货号 26002-20）将主动脉在黑色蜡盘上展平固定。 2. 涂生理盐水防止干燥。 3. 在蜡盘上标注小鼠编号，4 摄氏度保存；铺蜡后 3 天内必须完成成像与分析。

3. 成像

   用 Nikon 数码相机拍摄 en face 主动脉图像，画面内必须包含毫米标尺以校准测量；该 en face 方法设定三个区域，图像须分别包含：弓部区——心肌交界处至左锁骨下动脉远端 3 mm；胸段区——左锁骨下动脉远端 3 mm 至最后一支肋间动脉；腹段区——最后一支肋间动脉至髂动脉分叉。图像存为 JPEG 或 TIFF。

4. 定量与盲法复核

   1. 使用 Image Pro Plus 5.0 或 7.0 软件进行定量。 2. 以图像为底标注病变的同时，通过显微镜同步核对主动脉实况。 3. 定量结果由不知实验分组的第二观察者复核。复核完毕后，主动脉去针，转入正确标记的加样管，用含 0.02% 叠氮钠的生理盐水于室温保存。

5. 软件空间标定

   1. 打开 Image Pro（5.0 或 7.0）及待测图像。 2. 进入 Measure ▸ Calibrate ▸ Spatial Calibration。 3. 选择 Spatial Calibration Wizard 按提示操作，或点击 New 命名本次标定。 4. 选择 Image，将定标线对准标尺并把参考单位改为 mm，点击 OK 后 Apply。

6. 图像标注

   1. 点击标注按钮（Annotate），输入文字（研究名、小鼠编号、日期）后确定，将标签烧录进图像（双箭头按钮）。 2. 保存图片，并对其余图像重复标注。

7. 分区描记与病变面积测量

   1. 为每张打开的图像选择正确标定：Measure ▸ Calibration ▸ Set System ▸ Apply。 2. 打开 Measurements 测量面板，选择直线工具在标尺上量取 3 mm。 3. 用直线工具定义弓部区边界：使线的一端落在左锁骨下动脉根部，作为弓部与胸段的分隔标记。 4. 选择多边形工具描记弓部区内膜总面积，再在图像上描记弓部区病变，同时通过显微镜核对主动脉实况。 5. 自弓部区末端量至最后一支肋间动脉（约 17 mm），勾出胸段；通过显微镜核对并在图像上描记胸段病变。 6. 勾出腹段：自胸段末端至髂动脉分叉（可选：定量可包含双侧髂动脉各 1 mm），描记腹段病变并经显微镜核对。

8. 数据导出

   1. 在 Input/Output 选项卡选择测量项并点击 Export Now，粘贴入电子表格。 2. 保存测量图像：Input/Output 选项卡另存为“小鼠编号….msr”，此时可打印带叠加层的图像。 3. 在图像打印、保存且测量值已录入电子表格之前，不得关闭图像。

质量控制与输出

每张图像内必须含毫米标尺并完成对应空间标定；铺蜡固定后 3 天内完成成像与分析；病变描记须与显微镜下实况核对；全部定量须经对分组不知情的第二观察者复核；测量导出前完成打印、保存与记录。

以 Image Pro Plus 经毫米空间标定后，按弓部、胸段、腹段分区测量内膜病变面积并导出至电子表格；分区内膜总面积与病变描记同步经显微镜核对，定量由第二观察者盲法复核。

盲法

病变面积的复核由对实验分组不知情的第二观察者完成。

技术服务