脑组织 RNA 第一链 cDNA 合成

适用范围与方法

样本：纯化脑组织总 RNA。

反转录与 cDNA 合成

• Wistar ICV-STZ rat

  年龄

  3–4月龄

  性别

  雄性

  组织

  脑组织来源总 RNA

试剂与材料

• ProtoScript II Reverse Transcriptase（M0368S）
• 5X ProtoScript II RT Reaction Buffer
• Murine RNase Inhibitor（M0314S）
• 0.1 M DTT 反转录工作液
• dNTP 混合液（N0447S）
• 反转录随机引物混合液（60 µM）
• 无核酸酶水（Nuclease-free water）

实验流程

1. 配制 RNA 与引物混合液

   在无菌离心管中加入 RNA：总 RNA 1ng-1 µg 或 poly(A) RNA 1-100 ng；引物 2 µl（50 µM dT 或 60 µM Random Primer Mix）；10 mM dNTP 混合液 1 µl。用无核酸酶水补至 12 µl。

2. RNA 变性

   可将混合液置 65 °C - 70 °C 加热 3-5 minutes，短暂离心后立即置冰上。

3. 配制反转录体系

   加入 4 µl 5X ProtoScript II RT Reaction buffer、2 µl 0.1 M DTT、1 µl Murine RNase inhibitor（40 U/µl）和 1 µl ProtoScript II Reverse Transcriptase（200 U/µl），总体积 20 µl。

4. 随机引物退火

   使用 Random Primer Mix 时，在 42 °C 反应前，先于 25 °C 孵育 00:05:00。

5. 反转录

   42 °C 孵育 30 minutes-1 hour。

6. 酶失活

   80 °C 孵育 00:05:00。

7. 保存 cDNA

   产物置 -20 °C 保存，或进入后续检测。

质量控制与输出

使用完整且无 RNase 污染的 RNA；记录各样品输入量并检查无反转录对照。后续定量采用一致的 cDNA 输入量。

第一链 cDNA，用于后续目标序列扩增。

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