FFPE 肾组织切片 PAS 染色

Scope and method

Sample：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肾组织切片（载于玻片）

PAS 染色 (糖原/粘蛋白)

• eNOS 缺失 db/db 糖尿病肾病参考模型（文献参考）

  Age

  26 周龄

  Tissue

  肾组织

Reagents and materials

• PAS 染色试剂盒（黏液染色，Abcam ab150680）
• 组织学级二甲苯（Sigma-Aldrich 534056）
• Ethanol
• 95% 乙醇溶液
• 70%乙醇
• 0.5% 高碘酸溶液
• Schiff 试剂（Richard Allan Scientific 88017）
• 苏木素染液
• 0.5% 氢氧化铵返蓝液
• 95% 乙醇溶液
• Ethanol
• 组织学级二甲苯（Sigma-Aldrich 534056）
• Cytoseal 封片剂

Procedure

1. 试剂盒平衡至室温

   将 PAS 商品化染色试剂盒置于台面平衡至室温。

2. 二甲苯脱蜡

   石蜡切片在二甲苯中脱蜡，换液 2 次，每次 00:03:00。

3. 梯度酒精复水

   经梯度酒精复水，每级 00:01:00：100%、100%、95%、70%、水。

4. 蒸馏水充分漂洗

   手指按住玻片在流水池充分漂洗蒸馏水：向水池倾倒并补水冲洗，重复 5 次。

5. 蒸馏水漂洗

   用蒸馏水漂洗（操作同第 4 步）。

6. 0.5% 高碘酸氧化

   置于 0.5% 高碘酸溶液中 00:10:00（氧化）。

7. 蒸馏水充分漂洗

   蒸馏水充分漂洗（操作同第 4 步）。

8. Schiff 试剂染色

   将 Schiff 试剂倒入盛有玻片的 Coplin 染色缸，室温静置 15–30 分钟（肾样品约 30 分钟）。

9. 温水冲洗显色

   在约 40 °C 流动温蒸馏水或自来水中冲洗（操作同第 4 步）；冲洗后组织应呈粉色。

10. 置入活动玻片架

    将玻片放入可移动式灰色玻片架。

11. 苏木素复染

    在染色线的苏木素液中复染 00:01:00。

12. 蒸馏水漂洗

    蒸馏水充分漂洗，从苏木素缸旁的蓝色容器开始（操作同第 4 步）。

13. 返蓝

    将玻片快速浸入返蓝液（0.5% 氢氧化铵）。

14. 漂洗至显粉色

    蒸馏水中漂洗 1 分钟，直至可见粉色（操作同第 4 步）。

15. 梯度酒精脱水

    经梯度酒精脱水，每级短促浸蘸 10 次：95%、95%、100%、100%。若末次 100% 乙醇漂洗液被残余染料着色，应再以新 100% 乙醇洗涤。

16. 二甲苯透明

    在 2 轮二甲苯中透明固定，每轮 00:01:00（在通风橱内操作）。

17. 封片

    封片：玻片置于吸水纸；在盖玻片边缘加 2–3 滴 Cytoseal 封片剂（视尺寸而定）；将玻片浸入二甲苯后取出，沿玻片纵向滚推二甲苯；对齐玻片与盖玻片，缓慢将玻片覆于盖玻片上；必要时用解剖工具排除气泡。

18. 切片扫描成像

    使用 Leica 明场扫描仪 AxioScan Z1 玻片扫描仪（或等效设备）以 20x（约 1 µm 空间分辨率）扫描切片，存为 .tiff 或 .jpg。

Quality control and readouts

Schiff 试剂有效性检查：向 2 mL Schiff 试剂中滴入 3 滴福尔马林，应立即变紫；试剂按瓶身效期与约 1 个月复用期使用；温水冲洗后组织应显粉色，返蓝漂洗至可见粉色方可脱水；末次 100% 乙醇若被残余染料着色须换新液复洗。

获得 PAS 染色的肾组织切片图像：糖原、粘蛋白、基底膜等含多糖结构呈品红/粉色，苏木素复染核呈蓝色；成像文件（20x，约 1 µm 分辨率）用于后续肾组织形态学观察。

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