C57BL/6 MPTP 黑质纹状体变性参考模型（文献参考）

以预先生成的 cDNA 为输入的 SYBR Green 实时定量 PCR 检测。每孔加入 10 ng cDNA，技术三重复；使用 PowerUp SYBR Green Master Mix 与 5 µM 正反向引物；按源方案循环条件扩增并读取 CT，以看家基因和参考实验组进行 ΔΔCT 分析。具体基因、引物和生物学分组按各研究设计确定。

各样品目标序列的 CT 值；以看家基因归一化并以参考实验组计算 ΔΔCT/相对表达量。本方案不包含具体基因或疾病特异结论，输出判读依赖所选的引物、看家基因和实验分组。

以荧光显微镜在脑切片中观察TH阳性胞体与纤维并采集图像；本方案输出为免疫荧光染色与成像结果，不包含体视学细胞计数、纤维密度阈值或纹状体多巴胺浓度测定。

qPCR 反应体系 **Option 2****: SYBR qPCR** qPCR 反应体系 Prepare SYBR Master mix (ul per well): 1. 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix (#A25776, Applied Biosystem-ThermoFisher) 1. 1ul Primers (Forward and Reverse, diluted in Nuclease-free water at 5µM) qPCR 反应体系 Add 6ul of SYBR Master mix to each well with an automatic pipette (Multipette E3, Eppendorf) qPCR 反应体系 Add 4ul of cDNA per well (10ng cDNA) in technical triplicates to each well of LightCycler 480 Multiwell 384-plate (#4729749001, Roche Diagnostics) 热循环 Perform PCR using the following cycling conditions in a LightCycler® 480 System (Roche): 1. 50˚C for 2min 1. 95˚C for 2min 1. 95˚C for 15s + 60˚C for 1min (x40cycles) 数据分析 Using the LightCycler Software obtain the threshold cycles (CT) signals from each samples. 数据分析 Perform ΔΔCT-method to analyze the expression data using the endogenous control genes and the reference experimental group.

脑切片洗涤 用4% PFA/PBS洗涤脑切片一次。 去除固定液 以轻柔摇动或旋转5分钟，确保彻底去除固定液。 PBS漂洗 用PBS短暂漂洗，去除残留PFA。 封闭液配制 配制含10%驴血清和0.3% Triton-X的PBS封闭液。 封闭 室温下将切片在封闭液中孵育1小时，以减少非特异性结合。 均匀封闭 将切片置于摇床或旋转器上，使切片均匀接触封闭液。 一抗工作液配制 按下列组成配制一抗工作液。 加入鸡抗TH一抗 鸡抗TH抗体（Abcam，货号ab76442）。 稀释一抗 用含2.5%驴血清和0.3% Triton-X的PBS将一抗按1:200稀释。 一抗孵育 切片与一抗在室温孵育1小时。 湿盒孵育 在湿盒中孵育，防止液体蒸发。 一抗后洗涤 用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。 轻柔洗涤 洗涤过程中保持轻柔摇动或旋转。 二抗孵育 与针对鸡IgG的荧光偶联二抗按1:1000在室温孵育1小时。 避光 避光以保护荧光。 终末洗涤 用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。 避光洗涤 在避光条件下完成洗涤，以维持荧光完整性。 贴片 将切片贴于包被载玻片上。 Mowiol封片 用Mowiol封片介质覆盖切片并加盖玻片。 干燥 避光干燥至少30分钟后再成像。 荧光显微镜成像 使用Leica DM6000 B显微镜和10×物镜观察切片。 选择滤光片 使用合适的荧光滤光片组检测二抗信号。 调整曝光 调整曝光设置以优化信噪比。