cDNA 模板的实时定量 PCR（qPCR，SYBR Green 分支）

适用范围与方法

样本：cDNA (10 ng per well)

RT-qPCR 通用

• db/db (Lepr^db)

  组织

  按研究设计确定

• ApoE⁻⁻ 动脉粥样硬化模型

  组织

  liver

• C57BL/6 MPTP 黑质纹状体变性参考模型（文献参考）

  组织

  substantia nigra and striatum

• AOM/DSS 结肠炎相关结肠肿瘤模型（文献参考）

  组织

  colon lamina propria mononuclear cells

• OVA 致敏激发过敏性气道炎症模型（文献参考）

  组织

  BALF cells and lung tissue

• C57BL/6J

  组织

  按研究设计确定

• 脊髓挫伤损伤模型（小鼠，文献参考）

  组织

  spinal cord

• LPS 相关急性肺部炎症模型（免疫研究参考）

  组织

  lung

试剂与材料

• SYBR Green qPCR Master Mix
• qPCR 正反向引物（5 µM）
• 无核酸酶水（Nuclease-free water）

实验流程

1. qPCR 反应体系

   **Option 2****: SYBR qPCR**

2. qPCR 反应体系

   Prepare SYBR Master mix (ul per well): 1. 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix (#A25776, Applied Biosystem-ThermoFisher) 1. 1ul Primers (Forward and Reverse, diluted in Nuclease-free water at 5µM)

3. qPCR 反应体系

   Add 6ul of SYBR Master mix to each well with an automatic pipette (Multipette E3, Eppendorf)

4. qPCR 反应体系

   Add 4ul of cDNA per well (10ng cDNA) in technical triplicates to each well of LightCycler 480 Multiwell 384-plate (#4729749001, Roche Diagnostics)

5. 热循环

   Perform PCR using the following cycling conditions in a LightCycler® 480 System (Roche): 1. 50˚C for 2min 1. 95˚C for 2min 1. 95˚C for 15s + 60˚C for 1min (x40cycles)

6. 数据分析

   Using the LightCycler Software obtain the threshold cycles (CT) signals from each samples.

7. 数据分析

   Perform ΔΔCT-method to analyze the expression data using the endogenous control genes and the reference experimental group.

质量控制与输出

cDNA 浓度与质量按上游 RNA 提取和反转录流程确定；每个样品设技术三重复；引物用无核酸酶水配制至 5 µM；使用与 SYBR Green 体系兼容的预混液并按厂商要求保存；固定循环条件并在同批内保持仪器与板型一致；CT 读取和 ΔΔCT 分析按源方案执行。

各样品目标序列的 CT 值；以看家基因归一化并以参考实验组计算 ΔΔCT/相对表达量。本方案不包含具体基因或疾病特异结论，输出判读依赖所选的引物、看家基因和实验分组。

研究设计

以预先生成的 cDNA 为输入的 SYBR Green 实时定量 PCR 检测。每孔加入 10 ng cDNA，技术三重复；使用 PowerUp SYBR Green Master Mix 与 5 µM 正反向引物；按源方案循环条件扩增并读取 CT，以看家基因和参考实验组进行 ΔΔCT 分析。具体基因、引物和生物学分组按各研究设计确定。

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