脑组织总 RNA 提取与柱上 DNA 去除

适用范围与方法

样本：冷冻脑组织；组织量与样品编号分别记录。

总 RNA 提取

• Wistar ICV-STZ rat

  年龄

  3–4月龄

  性别

  雄性

  组织

  脑组织

试剂与材料 BOM

实验流程

1. 核对样品位置

   按样品盒年份、编号与孔位定位样品。

2. 记录样品信息

   记录样品编号、动物编号、基因型、年龄和性别。

3. 记录组织量

   记录每份样品的组织量；组织量很少时无需再切分。

4. 清洁工作台

   用 70% 乙醇或 RNase Away 喷洒工作台。

5. 准备干冰

   准备两个装有干冰的容器，分别放置切分工具和组织样品。

6. 清洁切分工具

   用 70% 乙醇擦拭切板、刀片和镊子。不要在接触干冰的工具上喷 RNase Away，以免冻结；使用后的刀片放入锐器盒。

7. 准备耗材

   每个样品准备一支含白色研磨珠的绿色盖裂解管、三支 1.5 ml 管、一套离心柱与收集管，以及一支备用收集管，分别标记。

8. 复溶 DNase

   用随附的 550 µl 无 RNase 水复溶 DNase。

9. 配制 DNase 混合液

   每个样品配制 80 µl：8.0 µl 10X DNase I 反应缓冲液、10.0 µl 复溶的 DNase 和 62.0 µl 无 RNase 水。

10. 取出裂解试剂

    从 4°C 冰箱取出 TRIzol，放入通风橱。

11. 分装 TRIzol

    在通风橱中向每支裂解管加入 1000 μl TRIzol。

12. 加入脑组织

    按组织量切分样品，放入各自裂解管，颠倒混匀。

13. 浸没组织

    使组织完全浸没在 TRIzol 中，每份样品使用独立裂解管。

14. 清洁工具

    接触样品前、不同样品之间及操作后，用 70% 乙醇擦拭工具。

15. 暂停保存

    需要暂停时，可在匀浆前将浸于 TRIzol 的样品置于 -80°C。

16. 准备冷却

    如选择湿冰冷却而非冷室操作，将工具容器中的干冰更换为湿冰。

17. 匀浆

    用组织匀浆仪处理各份样品。

18. 选择匀浆程序

    按组织类型选择推荐程序，多数程序运行 40 seconds。

19. 检查匀浆

    匀浆至组织在 TRIzol 中呈细颗粒分散。小块脑组织通常进行一轮 40 second 匀浆；较大脏器或较多组织可能需要三轮。脑组织匀浆后出现的粉红泡沫通常会在数分钟后消退。

20. 匀浆间冷却

    需重复匀浆时，两轮之间将裂解管置湿冰或冷室 2-mins，避免匀浆产热导致 RNA 降解。

21. 裂解静置

    将 TRIzol 匀浆液静置 5 mins。

22. 准备氯仿管

    在通风橱中向新的 1.5 ml 管加入 200 μl 氯仿。

23. 转移裂解液

    在通风橱中向含氯仿的管加入 1000 μl TRIzol 裂解液。不要将 200 μl 氯仿直接加入含研磨珠的裂解管，以免影响分层。

24. 混合分相液

    轻柔颠倒混匀 15-30 secs。

25. 室温静置

    室温静置 2-3 mins。

26. 低温分相离心

    在 4°C、12,000xg 离心 15 mins。

27. 转移水相

    将上层水相 400 μl 转移至新的 1.5 ml 管，可用 P200 分两次各转移 200 μl。

28. 加入乙醇

    向含 RNA 的水相加入 400-600 μl 70% 乙醇。

29. 混匀上柱液

    轻柔吹打 4-5 次，水相与乙醇保持 1:1，混至不再见 RNA 絮状物。70% 乙醇工作分装液可置室温，使用 15 ml 管。70% 乙醇以 70 ml 无水（100%）乙醇和 30 ml 无 RNase 水配制，储备液置 4°C。

30. 上柱

    向带收集管的离心柱加入 500 µl 样品。

31. 离心结合

    室温、12,000xg 离心 20 secs。

32. 弃流出液

    仅弃流出液，保留收集管。

33. 处理剩余样品

    重复上柱、离心和弃流出液，直至全部样品通过柱膜。RNA 留在柱膜上，随后以无 RNase 水洗脱。

34. 柱上 DNase 处理

    向离心柱加入 350 µl Wash Buffer I，室温、12,000g 离心 20 secs，弃流出液和收集管，换新收集管。在柱膜中央加入 80 µl PureLink DNase 混合液，室温孵育 15 mins。再次加入 350 µl Wash Buffer I，室温、12,000g 离心 20 secs，弃流出液和收集管，换新收集管，继续 Wash Buffer II 洗涤。

35. 加入洗涤液

    向离心柱加入 500 µl Wash Buffer II。

36. 洗涤离心

    室温、12,000xg 离心 20 secs。

37. 弃洗涤流出液

    仅弃流出液，保留收集管。

38. 重复洗涤

    再进行一次 Wash Buffer II 加样、离心和弃流出液。

39. 离心干燥

    室温、12,000xg 离心 1 min，使柱膜干燥。

40. 更换洗脱管

    弃流出液和收集管，将柱放入新的 1.5 ml 管。

41. 加入洗脱水

    向柱膜中央加入 30 µl 无 RNase 水。

42. 静置洗脱

    室温静置 30 secs。

43. 收集 RNA

    室温、12,000xg 离心 2 mins；经过 DNase 处理的样品将离心时间减为 1 min。如收集管破损，将洗脱液转入新的 1.5 ml 管。

44. 保存 RNA

    RNA 置 -80°C 保存；操作期间置湿冰，避免长时间留在室温。

质量控制与输出

逐样品记录组织量、RNA 浓度与完整性；避免 RNase 污染和残留乙醇。下游基因表达检测设置无反转录对照，检查残留 DNA 的影响。

经 DNase 处理的总 RNA、RNA 浓度和质量记录。

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