实验小鼠心脏灌注固定：解剖学研究组织标本制备
浏览实验方案成年小鼠经腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）麻醉后开胸，经左心室插管依次灌注预洗液与4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定液，流程中包含经左心室注射荧光标记番茄凝集素以在体标记动脉与毛细血管系统的步骤。目标组织采集后于固定液内4°C后固定，经0.1 M PBS（pH 7.2）漂洗后转入含0.1%叠氮钠的PBS于4°C保存，输出形态保存良好的组织，供解剖学观察及免疫组织化学等显微分析使用。实施本方案前须获得相应的动物实验伦理批准。
适用范围与方法
样本：成年小鼠组织（脑、脊髓、神经节及脏器）
- C57 小鼠 MCAO 线栓模型
- 年龄
- adult
- 组织
- brain
- 5xFAD 转基因模型
- 年龄
- adult
- 组织
- brain
- 3xTg-AD 转基因模型
- 年龄
- adult
- 组织
- brain
试剂与材料
实验流程
灌注前溶液配制
配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。
麻醉诱导
通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。
开胸与左心室插管
打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。
动脉与毛细血管系统标记
如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。
预洗液灌注冲洗
以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。
固定液灌注
灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。
组织采集与后固定
解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。
PBS漂洗
用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。
保存
置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。
质量控制与输出
预洗以右心房产出液清亮、肝脏与四肢苍白为完成判据；固定以器官变硬、组织充分保存为完成判据；预洗液临用前配制，固定液使用前配制不超过48小时并4°C保存、灌注当日恢复至室温；含0.1%叠氮钠的保存液与基于辣根过氧化物酶（HRP）的检测体系不兼容（叠氮钠抑制HRP）。
方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。
参考文献
- Keast JR, Bowden L, Osborne PB. Intracardiac perfusion of experimental mice with fixative for anatomical studies. protocols.io 记录227096, v1（2026-09-10发布）. DOI:10.17504/protocols.io.bp2l6z7xdgqe
- Thermo Fisher Scientific, IHC Troubleshooting Guide (Pierce Protein Methods): Sodium azide inhibits HRP（叠氮钠抑制辣根过氧化物酶活性）