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实验小鼠心脏灌注固定：解剖学研究组织标本制备

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Adult mice are anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (150 mg/kg) with xylazine (15 mg/kg); the chest is opened and a needle connected to a peristaltic pump is placed in the left ventricle, and a prewash solution followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) is perfused. A step in the flow labels the arterial and capillary systems in vivo with DyLight 649-conjugated tomato lectin injected into the left ventricle. Dissected tissues are post-fixed at 4 °C for 18–24 h, washed in 0.1 M PBS (pH 7.2) and stored at 4 °C in PBS containing 0.1% sodium azide until used for immunohistochemistry or other microscopic analysis, yielding well-preserved tissue for anatomical studies. Institutional animal ethics approval must be obtained before performing this procedure.

Scope and method

Sample：成年小鼠组织（脑、脊髓、神经节及脏器）

细胞与组织固定

Reagents and materials

Procedure

  1. 灌注前溶液配制

    配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。

  2. 麻醉诱导

    通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。

  3. 开胸与左心室插管

    打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。

  4. 动脉与毛细血管系统标记

    如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。

  5. 预洗液灌注冲洗

    以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。

  6. 固定液灌注

    灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。

  7. 组织采集与后固定

    解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。

  8. PBS漂洗

    用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。

  9. 保存

    置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。

Quality control and readouts

预洗以右心房产出液清亮、肝脏与四肢苍白为完成判据；固定以器官变硬、组织充分保存为完成判据；预洗液临用前配制，固定液使用前配制不超过48小时并4°C保存、灌注当日恢复至室温；含0.1%叠氮钠的保存液与基于辣根过氧化物酶（HRP）的检测体系不兼容（叠氮钠抑制HRP）。

方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。

References

  1. Keast JR, Bowden L, Osborne PB. Intracardiac perfusion of experimental mice with fixative for anatomical studies. protocols.io 记录227096, v1（2026-09-10发布）. DOI:10.17504/protocols.io.bp2l6z7xdgqe
  2. Thermo Fisher Scientific, IHC Troubleshooting Guide (Pierce Protein Methods): Sodium azide inhibits HRP（叠氮钠抑制辣根过氧化物酶活性）

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