大鼠脑组织 Sirt1 转录本定量（cDNA qPCR）

分别扩增 Sirt1 与 GAPDH，以 GAPDH 为内参，比较大鼠脑组织来源 cDNA 中的 Sirt1 相对表达量。

适用范围与方法

样本：大鼠脑组织 RNA 经反转录获得的 cDNA；每孔 10 ng cDNA。

SYBR Green 反应
SYBR Green qPCR。
配制反应预混液
每孔配制 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776，Applied Biosystems–Thermo Fisher）和 1ul 正反向引物工作混合液（用无核酸酶水配至 5 µM）。
分装预混液
使用 Multipette E3 自动移液器，将 6ul SYBR 预混液加入每孔。
加入 cDNA
每孔加入 4ul cDNA（10 ng），置于 LightCycler 480 的 384 孔反应板（Roche，4729749001）；每项检测设置 3 个技术重复。
实时扩增
使用 LightCycler 480：50˚C 2 min；95˚C 2 min；随后 95˚C 15 s、60˚C 1 min，重复 40 个循环。
读取 Ct
使用 LightCycler 软件获取各样品的阈值循环数（Ct）。
表达量分析
使用内参基因和对照实验组，以 ΔΔCt 法分析表达数据。

核对 Sirt1 和 GAPDH 引物序列，分别检查扩增特异性、技术重复一致性及阴性对照。比较组使用一致的样品处理与分析方式；技术重复不计为独立动物数。GAPDH 用作内参前应确认在研究条件下表达稳定。

Sirt1 与 GAPDH 的 Ct 值、ΔCt、相对于对照组的 ΔΔCt，以及 Sirt1 相对表达量（2^−ΔΔCt）。