大鼠脑组织 Sirt1 转录本定量（cDNA qPCR）

Scope and method

Sample：大鼠脑组织 RNA 经反转录获得的 cDNA；每孔 10 ng cDNA。

实时定量 PCR（qPCR）

• Wistar ICV-STZ rat

  Age

  3–4月龄

  Sex

  Male

  Tissue

  脑组织来源 cDNA。

Reagents and materials

• PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776）
• 大鼠 Sirt1 qPCR 正反向引物对
• 大鼠 GAPDH qPCR 正反向引物对
• 无核酸酶水（Nuclease-free water）

Procedure

1. SYBR Green 反应

   SYBR Green qPCR。

2. 配制反应预混液

   每孔配制 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776，Applied Biosystems–Thermo Fisher）和 1ul 正反向引物工作混合液（用无核酸酶水配至 5 µM）。

3. 分装预混液

   使用 Multipette E3 自动移液器，将 6ul SYBR 预混液加入每孔。

4. 加入 cDNA

   每孔加入 4ul cDNA（10 ng），置于 LightCycler 480 的 384 孔反应板（Roche，4729749001）；每项检测设置 3 个技术重复。

5. 实时扩增

   使用 LightCycler 480：50˚C 2 min；95˚C 2 min；随后 95˚C 15 s、60˚C 1 min，重复 40 个循环。

6. 读取 Ct

   使用 LightCycler 软件获取各样品的阈值循环数（Ct）。

7. 表达量分析

   使用内参基因和对照实验组，以 ΔΔCt 法分析表达数据。

Quality control and readouts

核对 Sirt1 和 GAPDH 引物序列，分别检查扩增特异性、技术重复一致性及阴性对照。比较组使用一致的样品处理与分析方式；技术重复不计为独立动物数。GAPDH 用作内参前应确认在研究条件下表达稳定。

Sirt1 与 GAPDH 的 Ct 值、ΔCt、相对于对照组的 ΔΔCt，以及 Sirt1 相对表达量（2^−ΔΔCt）。

Study design

Sirt1 与 GAPDH 分别设置反应，每个样品的每项检测设 3 个技术重复；比较实验组与对照组的归一化表达量。

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