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脑切片酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色

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脑切片经4% PFA/PBS洗涤、10%驴血清/0.3% Triton-X封闭后，以鸡抗TH抗体ab76442（1:200）和抗鸡IgG荧光二抗（1:1000）孵育，Mowiol封片并以荧光显微镜成像，用于TH阳性胞体与纤维的定位观察。

适用范围与方法

样本：脑组织切片（游离漂浮切片；来源方案为小鼠脑切片）

immunohistochemistry

试剂与材料

实验流程

  1. 脑切片洗涤

    用4% PFA/PBS洗涤脑切片一次。

  2. 去除固定液

    以轻柔摇动或旋转5分钟，确保彻底去除固定液。

  3. PBS漂洗

    用PBS短暂漂洗，去除残留PFA。

  4. 封闭液配制

    配制含10%驴血清和0.3% Triton-X的PBS封闭液。

  5. 封闭

    室温下将切片在封闭液中孵育1小时，以减少非特异性结合。

  6. 均匀封闭

    将切片置于摇床或旋转器上，使切片均匀接触封闭液。

  7. 一抗工作液配制

    按下列组成配制一抗工作液。

  8. 加入鸡抗TH一抗

    鸡抗TH抗体（Abcam，货号ab76442）。

  9. 稀释一抗

    用含2.5%驴血清和0.3% Triton-X的PBS将一抗按1:200稀释。

  10. 一抗孵育

    切片与一抗在室温孵育1小时。

  11. 湿盒孵育

    在湿盒中孵育，防止液体蒸发。

  12. 一抗后洗涤

    用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。

  13. 轻柔洗涤

    洗涤过程中保持轻柔摇动或旋转。

  14. 二抗孵育

    与针对鸡IgG的荧光偶联二抗按1:1000在室温孵育1小时。

  15. 避光

    避光以保护荧光。

  16. 终末洗涤

    用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。

  17. 避光洗涤

    在避光条件下完成洗涤，以维持荧光完整性。

  18. 贴片

    将切片贴于包被载玻片上。

  19. Mowiol封片

    用Mowiol封片介质覆盖切片并加盖玻片。

  20. 干燥

    避光干燥至少30分钟后再成像。

  21. 荧光显微镜成像

    使用Leica DM6000 B显微镜和10×物镜观察切片。

  22. 选择滤光片

    使用合适的荧光滤光片组检测二抗信号。

  23. 调整曝光

    调整曝光设置以优化信噪比。

质量控制与输出

按来源保留4% PFA/PBS初次洗涤、10%驴血清/0.3% Triton-X封闭1小时、鸡抗TH ab76442按1:200稀释并孵育1小时、抗鸡IgG荧光二抗按1:1000稀释并孵育1小时、PBS洗涤三次各5分钟及避光条件；成像使用合适荧光滤光片组并调整曝光以优化信噪比。来源未规定阴性对照、体视学计数或多巴胺浓度测定。

以荧光显微镜在脑切片中观察TH阳性胞体与纤维并采集图像；本方案输出为免疫荧光染色与成像结果，不包含体视学细胞计数、纤维密度阈值或纹状体多巴胺浓度测定。

参考文献

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