eNOS 缺失 db/db 糖尿病肾病参考模型（文献参考）

FFPE 肾组织切片的 PAS 染色流程，按源方案 FFPE 分支执行脱蜡、复水、氧化、Schiff 显色、苏木素复染、脱水透明和封片。具体切片厚度、视野与定量方法按研究设计确定。

获得 PAS 染色的肾组织切片图像：糖原、粘蛋白、基底膜等含多糖结构呈品红/粉色，苏木素复染核呈蓝色；成像文件（20x，约 1 µm 分辨率）用于后续肾组织形态学观察。

肾小球基底膜、系膜基质和糖蛋白呈 PAS 阳性（品红/紫红色），细胞核呈蓝色；按研究设计进行肾小球系膜扩张或病变范围判读。

试剂盒平衡至室温 将 PAS 商品化染色试剂盒置于台面平衡至室温。 二甲苯脱蜡 石蜡切片在二甲苯中脱蜡，换液 2 次，每次 00:03:00。 梯度酒精复水 经梯度酒精复水，每级 00:01:00：100%、100%、95%、70%、水。 蒸馏水充分漂洗 手指按住玻片在流水池充分漂洗蒸馏水：向水池倾倒并补水冲洗，重复 5 次。 蒸馏水漂洗 用蒸馏水漂洗（操作同第 4 步）。 0.5% 高碘酸氧化 置于 0.5% 高碘酸溶液中 00:10:00（氧化）。 蒸馏水充分漂洗 蒸馏水充分漂洗（操作同第 4 步）。 Schiff 试剂染色 将 Schiff 试剂倒入盛有玻片的 Coplin 染色缸，室温静置 15–30 分钟（肾样品约 30 分钟）。 温水冲洗显色 在约 40 °C 流动温蒸馏水或自来水中冲洗（操作同第 4 步）；冲洗后组织应呈粉色。 置入活动玻片架 将玻片放入可移动式灰色玻片架。 苏木素复染 在染色线的苏木素液中复染 00:01:00。 蒸馏水漂洗 蒸馏水充分漂洗，从苏木素缸旁的蓝色容器开始（操作同第 4 步）。 返蓝 将玻片快速浸入返蓝液（0.5% 氢氧化铵）。 漂洗至显粉色 蒸馏水中漂洗 1 分钟，直至可见粉色（操作同第 4 步）。 梯度酒精脱水 经梯度酒精脱水，每级短促浸蘸 10 次：95%、95%、100%、100%。若末次 100% 乙醇漂洗液被残余染料着色，应再以新 100% 乙醇洗涤。 二甲苯透明 在 2 轮二甲苯中透明固定，每轮 00:01:00（在通风橱内操作）。 封片 封片：玻片置于吸水纸；在盖玻片边缘加 2–3 滴 Cytoseal 封片剂（视尺寸而定）；将玻片浸入二甲苯后取出，沿玻片纵向滚推二甲苯；对齐玻片与盖玻片，缓慢将玻片覆于盖玻片上；必要时用解剖工具排除气泡。 切片扫描成像 使用 Leica 明场扫描仪 AxioScan Z1 玻片扫描仪（或等效设备）以 20x（约 1 µm 空间分辨率）扫描切片，存为 .tiff 或 .jpg。

Start with FFPE here: Allow PAS “kit” to come to room temperature on the bench. Start with FFPE here: For paraffin sections, deparaffinize in xylene, two changes, 00:03:00 each. Start with FFPE here: Hydrate through graded alcohols, 00:01:00 each: 100%, 100%, 95%, 70%, water Start with FFPE here: Rinse well in distilled water by holding finger over slides, pouring water into sink and adding water. Do this 5 times. Start Frozen samples here: Place in 0.5% Periodic acid for 00:10:00 (to oxidize). Start Frozen samples here: Rinse well in distilled water (follow Step 4). Start Frozen samples here: Pour Schiff’s reagent into Coplin jar containing slides. Allow to sit 15-30 minutes at room temperature (kidney samples ~30 minutes). Start Frozen samples here: Rinse in running warm (~40 °C) distilled or tap water (follow Step 4). The tissue should appear pink after rinsing with warm water. Start Frozen samples here: Place slides in movable gray slide holder. Start Frozen samples here: Counterstain in Hematoxylin (staining line) for 00:01:00. Start Frozen samples here: Rinse well in distilled water, starting with blue container next to hematoxylin (follow Step 4). Start Frozen samples here: Quickly dip slides into “Bluing” agent (0.5% ammonium hydroxide). Start Frozen samples here: Rinse 1 minute in distilled water until pink color is visible (follow Step 4). Start Frozen samples here: Dehydrate through graded alcohols, 10 short dips in each: 95%, 95%, 100%, 100% If the last 100% ethanol rinse is colored by residual stain, additional washing in new 100% ethanol solution should be performed. Start Frozen samples here: Fix in 2 rounds of xylenes, 00:01:00 each (in the hood). Start Frozen samples here: Coverslip slides: - Place coverslip on paper towel - Add 2-3 drops of cytoseal to edge (depending on size) - Dip slide into xylenes, take out and roll the xylene lengthwise on slide - Line up slide and cover slip and slowly place the slide on the coverslip - If needed, use dissecting tool to remove bubbles Start Frozen samples here: Image slides using a Leica brightfield scanner, AxioScan Z1 slide scanner (or equivalent) at 20x (~1 µm spatial resolution) and save as.tiff or.jpg file.