小鼠海马切片PSD95免疫荧光检测

Scope and method

Sample：已制备的固定小鼠游离海马脑组织切片

immunohistochemistry

• Tg2576 转基因淀粉样蛋白模型（APP695 Swedish）

  Age

  12 月龄入组，连续处理4周

  Tissue

  固定游离海马脑组织切片

Reagents and materials

• 盖玻片边缘封固用指甲油
• TBST 组织切片洗涤液（TBS、0.2% Triton X-100）
• Alexa Fluor 偶联二抗工作液（1:200，PSD95兔源一抗通道）
• 脑切片甘油/Tris/正丙基没食子酸酯封片液
• DAPI 核染工作液（1:50000，脑切片免疫荧光）
• 10% 正常山羊血清/TBST 封闭与一抗稀释液
• PSD95 兔源抗体（51-6900）

Procedure

1. 切片准备

   使用已制备的固定小鼠游离脑组织切片。

2. 切片洗涤

   使用含0.2% Triton X-100的1× TBS（TBST）洗涤脑切片。

3. 封闭

   进行非特异性结合封闭。

4. 血清封闭

   将切片置于TBST配制的10%正常山羊血清中，室温孵育1 h。

5. 一抗孵育

   使用PSD95兔源一抗进行免疫标记。

6. 一抗结合

   以10%正常山羊血清/TBST稀释一抗，4°C轻轻振荡孵育2–3夜。

7. PSD95一抗

   PSD95兔源抗体，货号51-6900，稀释比例1:300。

8. 二抗孵育

   使用与兔源一抗匹配的Alexa Fluor偶联二抗。

9. 一抗后洗涤

   使用TBST洗涤切片。

10. 荧光二抗结合

    将Alexa Fluor偶联二抗以1:200稀释于TBST，室温孵育2–3 h。

11. 封片

    完成免疫标记后进行封片。

12. 封片前洗涤

    使用TBST洗涤切片。

13. 封片介质

    使用90%甘油、20 mM Tris（pH 8.0）和0.5%正丙基没食子酸酯配制的封片介质，将切片封于载玻片上。

14. 盖玻片封固

    使用指甲油封固盖玻片边缘。

15. 细胞核标记

    使用DAPI进行细胞核染色。

16. DAPI核染

    在二抗孵育的最后10 min，将DAPI以1:50,000加入二抗孵育液。

17. 荧光成像

    记录免疫标记与细胞核染色的荧光图像。

18. 图像采集

    使用荧光显微镜采集图像，例如Olympus FV 3000。

Quality control and readouts

二抗与兔源一抗匹配；分别记录PSD95荧光信号与DAPI核染信号。

海马切片中PSD95免疫反应性及其空间分布，以DAPI标记的细胞核作为定位参照。

Study design

比较野生型-载体、野生型-NRG1、Tg2576-载体、Tg2576-NRG1四组海马切片中的PSD95免疫反应性。

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