5xFAD 转基因模型

重复训练后移除平台进行探测，比较训练过程中的学习曲线及探测试验的目标象限偏好。

每日从 N、S、E、W 四个方位下水，起始方位在动物和训练日之间随机排列。

实验操作与数据分析对分组设盲。

方案输出为灌注固定后形态保存良好的成年小鼠组织（如脑），适用于解剖学观察与免疫组织化学等后续显微检测；用量判据：预洗液约18–20 mL至流出液清亮、肝与四肢苍白，固定液90 mL至器官变硬。

每只动物报告百分比自发交替(交替次数/最大进入数,即三连进入次数/可能的三连总数,单位%)、臂进入总次数与移动距离;百分比交替显著降低提示工作记忆受损,判读以活动量指标与交替率不相关为前提。健康小鼠的百分比交替约为 70%,臂进入次数与移动距离同时反映运动与探索活动水平。

训练期逃避潜伏期、路径长度和游泳速度；探测期目标象限停留时间及搜索路径。

灌注前溶液配制 配制以下两种溶液。灌注预洗液：向100 ml 0.9%（w/v）氯化钠溶液中加入1.25 ml 1%（w/v）亚硝酸钠与0.04 ml肝素（5000 IU/ml），临用前配制。灌注固定液：4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4），使用前配制不超过48小时，4摄氏度保存，灌注当日恢复至室温。 麻醉诱导 通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）与赛拉嗪（15 mg/kg）诱导麻醉。 开胸与左心室插管 打开胸腔，将与管路（T型接头连接预洗液与灌注固定液）及蠕动泵（设置：18 ml/min）相连的针头插入左心室，并在右心房切一小口，以便操作过程中血液与灌注液流出。 动脉与毛细血管系统标记 如需特异性标记动脉与毛细血管系统，在打开胸腔暴露心脏后立即执行本步骤：使用31G针头将DyLight 649标记的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum，1 mg/ml）100 µl在30秒内直接注入左心室，等待一分钟使凝集素循环后再进行预洗液灌注。 预洗液灌注冲洗 以预洗液灌注，直至右心房产出液体清亮、肝脏与四肢苍白（通常约需18–20 ml预洗液）。 固定液灌注 灌注90 ml固定液，灌注完成时器官变硬、各组织得到良好保存。 组织采集与后固定 解剖采集分析所需组织，置于固定液中4摄氏度后固定18–24小时。 PBS漂洗 用磷酸盐缓冲液（PBS；0.1 M，pH 7.2）漂洗组织，每次30分钟，共3次。 保存 置于含0.1%叠氮钠的PBS中4摄氏度保存，直至用于免疫组织化学或其他显微分析。

适应行为室 测试前将小鼠带入行为室,适应至少 01:00:00。 70% 乙醇清洁迷宫 每次测试前用 70% 乙醇清洁每个迷宫,晾干后再开始测试。 开始跟踪并放入迷宫中央 先启动 EthoVision 记录,再将动物放入迷宫中央;若有多台 Y 迷宫,同笼鼠可同时测试。 离开房间记录 8 分钟 实验者离开房间,记录 8 min 后将动物放回原饲养笼。 判定一次臂进入 当动物除尾部外全身进入臂内时,判定其进入了该臂。 界定自发交替与可能三连 百分比交替=自发交替次数/可能的三连总数。例如动物按 B、C、A、C、A、B 顺序进入臂时,计 2 次自发交替(BCA 与 CAB),可能三连共 4 个(BCA、CAC、ACA、CAB),即 50% 交替。 以跟踪软件读数计算百分比交替 EthoVision 报告交替次数与最大进入数,后者代表可能的三连数,百分比交替=交替次数/最大进入数;健康小鼠的百分比交替应约为 70%。 活动量混杂对照 对照检查:确认最大进入数或移动距离与百分比交替不相关;若两者存在相关,说明动物活动量使百分比交替判读失真,已不能准确反映工作记忆表现。

训练试次 每天从 N、S、E、W 四个象限边缘的 4 个不同起始位置释放每只小鼠。每次给予至多 100 s 寻找隐蔽平台；到达平台后停留 15 s。若小鼠在 100 s 内未找到平台，引导其到平台并停留 15 s。试次间将小鼠放回铺有干燥垫料的暂养笼，间隔 15–30 min。动物之间及不同训练日的起始位置应随机排列，避免形成固定位置策略。 无平台探测试次 每个工作周结束时移除隐蔽平台，从原平台相对象限释放小鼠，自由游泳 100 s。使用 EthoVision 记录搜索路径。对目标象限的偏好反映空间记忆巩固。 数据分析 使用 EthoVision 自动计算路径长度（cm）、游泳速度（cm/s）及各区域或象限停留时间。分析训练日之间的逃避潜伏期和路径长度，形成学习曲线；探测试验比较目标象限与其他象限的停留时间，并采用适合研究设计的统计检验。WT 小鼠的逃避潜伏期应随训练逐渐下降，探测试验对目标象限的偏好应达到 >25% 停留时间。KO 小鼠若存在空间学习障碍，可表现为逃避潜伏期延长或缺少象限偏好。