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脑组织 RNA 第一链 cDNA 合成

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以纯化的脑组织总 RNA 为模板，使用 ProtoScript II 反转录酶合成第一链 cDNA，供后续基因表达检测。

适用范围与方法

样本：纯化脑组织总 RNA。

反转录与 cDNA 合成

试剂与材料 BOM

步骤品名角色用量必需 / 可选可替代条件SKU / 规格文献产品
配制 RNA 与引物混合液无菌微量离心管（cDNA合成用）配制脑组织RNA、引物与dNTP混合液，进入第一链cDNA合成流程。

原来源明确无菌微量离心管；未报告管容积或每次实验总量。

来源未报告必需来源未报告可询价来源未报告
配制反转录体系ProtoScript II Reverse Transcriptase（M0368S）第一链 cDNA 合成

ProtoScript II Reverse Transcriptase，M0368S，200 U/µl。

1 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制反转录体系5X ProtoScript II RT Reaction Buffer反转录缓冲体系

5X ProtoScript II RT Reaction Buffer。

4 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制反转录体系Murine RNase Inhibitor（M0314S）RNase 抑制

Murine RNase Inhibitor，M0314S，40 U/µl。

1 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制反转录体系0.1 M DTT 反转录工作液反转录还原组分

0.1 M DTT 工作液。

2 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制 RNA 与引物混合液dNTP 混合液（N0447S）cDNA 合成底物

dNTP 混合液，N0447S；10 mM 工作液。

1 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制 RNA 与引物混合液反转录随机引物混合液（60 µM）反转录引物

60 µM Random Primer Mix；采用随机引物时保留 25 °C 退火步骤。

2 µl/20 µl 反应必需来源未报告可询价来源未报告
配制 RNA 与引物混合液无核酸酶水（Nuclease-free water）反应补水

无核酸酶水。

RNA、引物与 dNTP 加入后补足至 12 µl必需来源未报告可询价来源未报告
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方案 #187 · 修订 3 无菌微量离心管（cDNA合成用） | 来源未报告 | 可询价 ProtoScript II Reverse Transcriptase（M0368S） | 1 µl/20 µl 反应 | 可询价 5X ProtoScript II RT Reaction Buffer | 4 µl/20 µl 反应 | 可询价 Murine RNase Inhibitor（M0314S） | 1 µl/20 µl 反应 | 可询价 0.1 M DTT 反转录工作液 | 2 µl/20 µl 反应 | 可询价 dNTP 混合液（N0447S） | 1 µl/20 µl 反应 | 可询价 反转录随机引物混合液（60 µM） | 2 µl/20 µl 反应 | 可询价 无核酸酶水（Nuclease-free water） | RNA、引物与 dNTP 加入后补足至 12 µl | 可询价

实验流程

  1. 配制 RNA 与引物混合液

    在无菌离心管中加入 RNA：总 RNA 1ng-1 µg 或 poly(A) RNA 1-100 ng；引物 2 µl（50 µM dT 或 60 µM Random Primer Mix）；10 mM dNTP 混合液 1 µl。用无核酸酶水补至 12 µl。

  2. RNA 变性

    可将混合液置 65 °C - 70 °C 加热 3-5 minutes，短暂离心后立即置冰上。

  3. 配制反转录体系

    加入 4 µl 5X ProtoScript II RT Reaction buffer、2 µl 0.1 M DTT、1 µl Murine RNase inhibitor（40 U/µl）和 1 µl ProtoScript II Reverse Transcriptase（200 U/µl），总体积 20 µl。

  4. 随机引物退火

    使用 Random Primer Mix 时，在 42 °C 反应前，先于 25 °C 孵育 00:05:00。

  5. 反转录

    42 °C 孵育 30 minutes-1 hour。

  6. 酶失活

    80 °C 孵育 00:05:00。

  7. 保存 cDNA

    产物置 -20 °C 保存，或进入后续检测。

质量控制与输出

使用完整且无 RNase 污染的 RNA；记录各样品输入量并检查无反转录对照。后续定量采用一致的 cDNA 输入量。

第一链 cDNA，用于后续目标序列扩增。

参考文献

  1. New England Biolabs. First Strand cDNA Synthesis Kit using ProtoScript II Reverse Transcriptase (M0368), protocols.io v2, 2022-04-11. · DOI: 10.17504/protocols.io.x14egnmmv5dy/v2
  2. Schisandrin ameliorates cognitive deficits, endoplasmic reticulum stress and neuroinflammation in streptozotocin (STZ)-induced Alzheimer’s disease rats. PMID:32336744. · DOI: 10.1538/expanim.19-0146

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