FFPE 脑切片 6E10 碱性磷酸酶免疫组织化学检测 Aβ/APP
浏览实验方案本方案采用 6E10 小鼠单克隆抗体在 2–3 µm FFPE 脑切片上进行碱性磷酸酶免疫组织化学染色，依次完成脱蜡复水、柠檬酸缓冲液热抗原修复、甲酸处理、过氧化氢与正常山羊血清封闭、一抗过夜孵育、碱性磷酸酶二抗孵育、FastBlue 显色及苏木素复染。6E10 识别包括 APP 在内的 β-淀粉样蛋白表位，染色信号不等同于仅由不溶性斑块产生，也不能给出 Aβ40/Aβ42 的绝对浓度。采用版本验证的样品为 FFPE 人脑组织；用于表达人源或人源化 Aβ 的小鼠模型脑组织时，需设置内源 IgG 与阴性对照并在结果解释中保留该边界。
适用范围与方法
样本：2–3 µm FFPE 脑组织切片；该来源版本验证的样品为 FFPE 人脑组织，用于表达人源或人源化 Aβ 的小鼠脑组织时属于基于靶标与流程的扩展应用。
- CC × 5xFAD F1 杂交队列
- 年龄
- 4、12 月龄
- 组织
- brain (cortex, subiculum)
- 3xTg-AD 转基因模型
- 年龄
- 6–12 月龄
- 组织
- brain (cortex, hippocampus)
- APP/PS1 参考品系（B6;C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax）
- 年龄
- 6–7 月龄
- 组织
- brain (cortex, hippocampus)
- Tg2576 转基因淀粉样蛋白模型（APP695 Swedish）
- 年龄
- 9–10 月龄
- 组织
- brain (cortex, limbic structures)
- APP23 转基因淀粉样蛋白模型（Swedish，神经元启动子）
- 年龄
- 6 月龄
- 组织
- brain (neocortex, hippocampus)
- J20 转基因淀粉样蛋白模型（APPSwInd，PDGFB）
- 年龄
- 5–10 月龄
- 组织
- brain (dentate gyrus, neocortex)
- PDAPP 转基因淀粉样蛋白模型（APP V717F Indiana）
- 年龄
- 18 月龄
- 组织
- brain
- TgCRND8 转基因淀粉样蛋白模型（Swedish+Indiana，PrP）
- 年龄
- 3 月龄
- 组织
- brain
- App NL-F 敲入模型（Swedish+Iberian 点突变）
- 年龄
- 6 月龄
- 组织
- brain (hippocampus, cortex)
- App NL-G-F 敲入模型（Swedish+Arctic+Iberian）
- 年龄
- 2–9 月龄
- 组织
- brain
试剂与材料
- 组织学二甲苯（混合异构体）
- FastBlue 碱性磷酸酶显色工作液（含 Naphtol AS Mix Phosphat、Levamisol、FastBlue）
- 苏木素染液
- Aquatex 水性封片剂
- 异丙醇（isopropanol）
- 蒸馏水（aqua dest，组织学染色用）
- 柠檬酸-柠檬酸钠抗原修复缓冲液（10 mM，pH 6）
- Tris 缓冲盐溶液（TBS，pH 7.5）
- 甲酸（formic acid，98%）
- 3% 过氧化氢/TBS 工作液（免疫组化封闭用）
- 正常山羊血清（normal goat serum）
- 6E10 抗人β-淀粉样蛋白小鼠单克隆抗体（Zytomed Z 932002-Y）
- 山羊抗小鼠 IgG 碱性磷酸酶偶联二抗（Jackson 115-055-003）
实验流程
石蜡切片准备
在 2–3 µm 厚石蜡切片上进行免疫组织化学染色。
去除多余石蜡
56° 下去除多余石蜡 1h–24h。
复水
复水。
二甲苯脱蜡
二甲苯 4 次，每次 5 min。
异丙醇:二甲苯过渡
异丙醇:二甲苯 1:1 处理 1 次，3 min。
100% 异丙醇
100% 异丙醇处理 2 次，每次 3 min。
90% 异丙醇
90% 异丙醇处理 1 次，3 min。
70% 异丙醇
70% 异丙醇处理 1 次，3 min。
50% 异丙醇
50% 异丙醇处理 1 次，3 min。
蒸馏水洗涤
用蒸馏水洗涤 3 次。
抗原修复
进行抗原修复。
柠檬酸缓冲液热修复
用 1× 柠檬酸缓冲液（10 mM，pH 6）加热修复，蒸汽处理 30 min。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
甲酸处理
室温下用 98% 甲酸处理 1 min，用于 β-淀粉样蛋白免疫组织化学。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
过氧化氢封闭
室温下用含 3% 过氧化氢的 TBS 处理 10 min。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
正常山羊血清封闭
室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 封闭 10 min。
倾去封闭液
倾去含 10% 正常山羊血清的 TBS，不洗涤，直接进入下一步。
一抗孵育
在湿盒中于室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 孵育一抗过夜。一抗为 6E10（Zytomed Systems GmbH，货号 Z 932002-Y），靶标人 β-淀粉样蛋白，小鼠宿主，按 1:500 稀释。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
碱性磷酸酶二抗孵育
在湿盒中于室温下孵育碱性磷酸酶偶联二抗 2 h，二抗按 1:100 稀释；二抗为 Jackson ImmunoResearch 115-055-003，山羊抗小鼠 IgG。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
FastBlue 显色
用 FastBlue 显色 30–60 min：49 mL TBS（pH 7.5）、1 mL Naphtol AS Mix Phosphat、50 µL Levamisol、25 mg FastBlue，混匀后过滤。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
苏木素复染
苏木素复染 10 s。
流水冲洗
自来水冲洗 10 min。
Aquatex 封片
用 Aquatex 封片。
质量控制与输出
每批染色设置已知含人源 Aβ 的阳性对照与省略一抗的阴性对照；小鼠脑组织另设省略一抗或小鼠 IgG 同型对照，以评估抗小鼠二抗与内源 IgG 的背景。只有阳性对照出现预期定位的蓝色沉积、阴性与内源 IgG 对照无相应信号时，才判读目标区域染色。
在目标脑区观察到 FastBlue 碱性磷酸酶底物形成的蓝色沉积，其分布与 6E10 反应性人源或人源化 Aβ/APP 表位一致；需结合阳性、阴性与内源 IgG 对照判读。该方案不单独区分 Aβ40 与 Aβ42，不把染色强度直接解释为不溶性斑块负荷或绝对浓度；如用于定量，需另建图像采集与分析方案。
参考文献
- Jonas Franz, Katja Schulz, Christine Stadelmann. Immunhistochemistry (Stadelmann Lab - single antibody, AP). protocols.io, v1, 2025-09-11. DOI: 10.17504/protocols.io.3byl4952rgo5/v1
- Sturchler-Pierrat et al. 1997. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. DOI:10.1073/pnas.94.24.13287; PMID:9371838.
- Johnson-Wood et al. 1997. Amyloid precursor protein processing and A beta42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease. DOI:10.1073/pnas.94.4.1550; PMID:9037091.
- RIKEN. 2014-04-14. New mouse model could revolutionize research in Alzheimer’s disease. Original laboratory figure for Saito et al., Nature Neuroscience 2014, DOI:10.1038/nn.3697.