FFPE 脑切片 6E10 碱性磷酸酶免疫组织化学检测 Aβ/APP
Browse experimental protocolsThis protocol uses the mouse monoclonal antibody 6E10 for alkaline-phosphatase immunohistochemistry on 2–3 µm FFPE brain sections, including dewaxing and rehydration, heat antigen retrieval in citrate buffer, formic acid treatment, hydrogen peroxide and normal goat serum blocking, overnight primary antibody incubation, alkaline-phosphatase secondary antibody incubation, FastBlue development and hematoxylin counterstaining. 6E10 recognizes beta-amyloid epitopes including APP, so the signal is not equivalent to insoluble plaque alone and does not give absolute Aβ40/Aβ42 concentrations. The validated source material is FFPE human brain; application to mouse brain expressing human or humanized Aβ requires endogenous-IgG and negative controls, and that boundary must remain in interpretation.
Scope and method
Sample：2–3 µm FFPE 脑组织切片；该来源版本验证的样品为 FFPE 人脑组织，用于表达人源或人源化 Aβ 的小鼠脑组织时属于基于靶标与流程的扩展应用。
- CC × 5xFAD F1 杂交队列
- Age
- 4、12 月龄
- Tissue
- brain (cortex, subiculum)
- 3xTg-AD 转基因模型
- Age
- 6–12 月龄
- Tissue
- brain (cortex, hippocampus)
- APP/PS1 参考品系（B6;C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax）
- Age
- 6–7 月龄
- Tissue
- brain (cortex, hippocampus)
- Tg2576 转基因淀粉样蛋白模型（APP695 Swedish）
- Age
- 9–10 月龄
- Tissue
- brain (cortex, limbic structures)
- APP23 转基因淀粉样蛋白模型（Swedish，神经元启动子）
- Age
- 6 月龄
- Tissue
- brain (neocortex, hippocampus)
- J20 转基因淀粉样蛋白模型（APPSwInd，PDGFB）
- Age
- 5–10 月龄
- Tissue
- brain (dentate gyrus, neocortex)
- PDAPP 转基因淀粉样蛋白模型（APP V717F Indiana）
- Age
- 18 月龄
- Tissue
- brain
- TgCRND8 转基因淀粉样蛋白模型（Swedish+Indiana，PrP）
- Age
- 3 月龄
- Tissue
- brain
- App NL-F 敲入模型（Swedish+Iberian 点突变）
- Age
- 6 月龄
- Tissue
- brain (hippocampus, cortex)
- App NL-G-F 敲入模型（Swedish+Arctic+Iberian）
- Age
- 2–9 月龄
- Tissue
- brain
Reagents and materials
- 组织学二甲苯（混合异构体）
- FastBlue 碱性磷酸酶显色工作液（含 Naphtol AS Mix Phosphat、Levamisol、FastBlue）
- 苏木素染液
- Aquatex 水性封片剂
- 异丙醇（isopropanol）
- 蒸馏水（aqua dest，组织学染色用）
- 柠檬酸-柠檬酸钠抗原修复缓冲液（10 mM，pH 6）
- Tris 缓冲盐溶液（TBS，pH 7.5）
- 甲酸（formic acid，98%）
- 3% 过氧化氢/TBS 工作液（免疫组化封闭用）
- 正常山羊血清（normal goat serum）
- 6E10 抗人β-淀粉样蛋白小鼠单克隆抗体（Zytomed Z 932002-Y）
- 山羊抗小鼠 IgG 碱性磷酸酶偶联二抗（Jackson 115-055-003）
Procedure
石蜡切片准备
在 2–3 µm 厚石蜡切片上进行免疫组织化学染色。
去除多余石蜡
56° 下去除多余石蜡 1h–24h。
复水
复水。
二甲苯脱蜡
二甲苯 4 次，每次 5 min。
异丙醇:二甲苯过渡
异丙醇:二甲苯 1:1 处理 1 次，3 min。
100% 异丙醇
100% 异丙醇处理 2 次，每次 3 min。
90% 异丙醇
90% 异丙醇处理 1 次，3 min。
70% 异丙醇
70% 异丙醇处理 1 次，3 min。
50% 异丙醇
50% 异丙醇处理 1 次，3 min。
蒸馏水洗涤
用蒸馏水洗涤 3 次。
抗原修复
进行抗原修复。
柠檬酸缓冲液热修复
用 1× 柠檬酸缓冲液（10 mM，pH 6）加热修复，蒸汽处理 30 min。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
甲酸处理
室温下用 98% 甲酸处理 1 min，用于 β-淀粉样蛋白免疫组织化学。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
过氧化氢封闭
室温下用含 3% 过氧化氢的 TBS 处理 10 min。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
正常山羊血清封闭
室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 封闭 10 min。
倾去封闭液
倾去含 10% 正常山羊血清的 TBS，不洗涤，直接进入下一步。
一抗孵育
在湿盒中于室温下用含 10% 正常山羊血清的 TBS 孵育一抗过夜。一抗为 6E10（Zytomed Systems GmbH，货号 Z 932002-Y），靶标人 β-淀粉样蛋白，小鼠宿主，按 1:500 稀释。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
碱性磷酸酶二抗孵育
在湿盒中于室温下孵育碱性磷酸酶偶联二抗 2 h，二抗按 1:100 稀释；二抗为 Jackson ImmunoResearch 115-055-003，山羊抗小鼠 IgG。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
FastBlue 显色
用 FastBlue 显色 30–60 min：49 mL TBS（pH 7.5）、1 mL Naphtol AS Mix Phosphat、50 µL Levamisol、25 mg FastBlue，混匀后过滤。
TBS 洗涤
用 TBS 洗涤 3 次。
苏木素复染
苏木素复染 10 s。
流水冲洗
自来水冲洗 10 min。
Aquatex 封片
用 Aquatex 封片。
Quality control and readouts
每批染色设置已知含人源 Aβ 的阳性对照与省略一抗的阴性对照；小鼠脑组织另设省略一抗或小鼠 IgG 同型对照，以评估抗小鼠二抗与内源 IgG 的背景。只有阳性对照出现预期定位的蓝色沉积、阴性与内源 IgG 对照无相应信号时，才判读目标区域染色。
在目标脑区观察到 FastBlue 碱性磷酸酶底物形成的蓝色沉积，其分布与 6E10 反应性人源或人源化 Aβ/APP 表位一致；需结合阳性、阴性与内源 IgG 对照判读。该方案不单独区分 Aβ40 与 Aβ42，不把染色强度直接解释为不溶性斑块负荷或绝对浓度；如用于定量，需另建图像采集与分析方案。
References
- Jonas Franz, Katja Schulz, Christine Stadelmann. Immunhistochemistry (Stadelmann Lab - single antibody, AP). protocols.io, v1, 2025-09-11. DOI: 10.17504/protocols.io.3byl4952rgo5/v1
- Sturchler-Pierrat et al. 1997. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. DOI:10.1073/pnas.94.24.13287; PMID:9371838.
- Johnson-Wood et al. 1997. Amyloid precursor protein processing and A beta42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease. DOI:10.1073/pnas.94.4.1550; PMID:9037091.
- RIKEN. 2014-04-14. New mouse model could revolutionize research in Alzheimer’s disease. Original laboratory figure for Saito et al., Nature Neuroscience 2014, DOI:10.1038/nn.3697.