Wistar ICV-STZ rat

Sirt1 与 GAPDH 分别设置反应，每个样品的每项检测设 3 个技术重复；比较实验组与对照组的归一化表达量。

Sirt1 与 GAPDH 的 Ct 值、ΔCt、相对于对照组的 ΔΔCt，以及 Sirt1 相对表达量（2^−ΔΔCt）。

经 DNase 处理的总 RNA、RNA 浓度和质量记录。

第一链 cDNA，用于后续目标序列扩增。

记录每次定位试验的到台潜伏期和游泳轨迹，比较相继试验中的空间定位表现。到达平台与达到时限未到台的情况按对应条件路径分别处理。

SYBR Green 反应 SYBR Green qPCR。 配制反应预混液 每孔配制 5ul PowerUp SYBR Green Master Mix（A25776，Applied Biosystems–Thermo Fisher）和 1ul 正反向引物工作混合液（用无核酸酶水配至 5 µM）。 分装预混液 使用 Multipette E3 自动移液器，将 6ul SYBR 预混液加入每孔。 加入 cDNA 每孔加入 4ul cDNA（10 ng），置于 LightCycler 480 的 384 孔反应板（Roche，4729749001）；每项检测设置 3 个技术重复。 实时扩增 使用 LightCycler 480：50˚C 2 min；95˚C 2 min；随后 95˚C 15 s、60˚C 1 min，重复 40 个循环。 读取 Ct 使用 LightCycler 软件获取各样品的阈值循环数（Ct）。 表达量分析 使用内参基因和对照实验组，以 ΔΔCt 法分析表达数据。

核对样品位置 按样品盒年份、编号与孔位定位样品。 记录样品信息 记录样品编号、动物编号、基因型、年龄和性别。 记录组织量 记录每份样品的组织量；组织量很少时无需再切分。 清洁工作台 用 70% 乙醇或 RNase Away 喷洒工作台。 准备干冰 准备两个装有干冰的容器，分别放置切分工具和组织样品。 清洁切分工具 用 70% 乙醇擦拭切板、刀片和镊子。不要在接触干冰的工具上喷 RNase Away，以免冻结；使用后的刀片放入锐器盒。 准备耗材 每个样品准备一支含白色研磨珠的绿色盖裂解管、三支 1.5 ml 管、一套离心柱与收集管，以及一支备用收集管，分别标记。 复溶 DNase 用随附的 550 µl 无 RNase 水复溶 DNase。 配制 DNase 混合液 每个样品配制 80 µl：8.0 µl 10X DNase I 反应缓冲液、10.0 µl 复溶的 DNase 和 62.0 µl 无 RNase 水。 取出裂解试剂 从 4°C 冰箱取出 TRIzol，放入通风橱。 分装 TRIzol 在通风橱中向每支裂解管加入 1000 μl TRIzol。 加入脑组织 按组织量切分样品，放入各自裂解管，颠倒混匀。 浸没组织 使组织完全浸没在 TRIzol 中，每份样品使用独立裂解管。 清洁工具 接触样品前、不同样品之间及操作后，用 70% 乙醇擦拭工具。 暂停保存 需要暂停时，可在匀浆前将浸于 TRIzol 的样品置于 -80°C。 准备冷却 如选择湿冰冷却而非冷室操作，将工具容器中的干冰更换为湿冰。 匀浆 用组织匀浆仪处理各份样品。 选择匀浆程序 按组织类型选择推荐程序，多数程序运行 40 seconds。 检查匀浆 匀浆至组织在 TRIzol 中呈细颗粒分散。小块脑组织通常进行一轮 40 second 匀浆；较大脏器或较多组织可能需要三轮。脑组织匀浆后出现的粉红泡沫通常会在数分钟后消退。 匀浆间冷却 需重复匀浆时，两轮之间将裂解管置湿冰或冷室 2-mins，避免匀浆产热导致 RNA 降解。 裂解静置 将 TRIzol 匀浆液静置 5 mins。 准备氯仿管 在通风橱中向新的 1.5 ml 管加入 200 μl 氯仿。 转移裂解液 在通风橱中向含氯仿的管加入 1000 μl TRIzol 裂解液。不要将 200 μl 氯仿直接加入含研磨珠的裂解管，以免影响分层。 混合分相液 轻柔颠倒混匀 15-30 secs。 室温静置 室温静置 2-3 mins。 低温分相离心 在 4°C、12,000xg 离心 15 mins。 转移水相 将上层水相 400 μl 转移至新的 1.5 ml 管，可用 P200 分两次各转移 200 μl。 加入乙醇 向含 RNA 的水相加入 400-600 μl 70% 乙醇。 混匀上柱液 轻柔吹打 4-5 次，水相与乙醇保持 1:1，混至不再见 RNA 絮状物。70% 乙醇工作分装液可置室温，使用 15 ml 管。70% 乙醇以 70 ml 无水（100%）乙醇和 30 ml 无 RNase 水配制，储备液置 4°C。 上柱 向带收集管的离心柱加入 500 µl 样品。 离心结合 室温、12,000xg 离心 20 secs。 弃流出液 仅弃流出液，保留收集管。 处理剩余样品 重复上柱、离心和弃流出液，直至全部样品通过柱膜。RNA 留在柱膜上，随后以无 RNase 水洗脱。 柱上 DNase 处理 向离心柱加入 350 µl Wash Buffer I，室温、12,000g 离心 20 secs，弃流出液和收集管，换新收集管。在柱膜中央加入 80 µl PureLink DNase 混合液，室温孵育 15 mins。再次加入 350 µl Wash Buffer I，室温、12,000g 离心 20 secs，弃流出液和收集管，换新收集管，继续 Wash Buffer II 洗涤。 加入洗涤液 向离心柱加入 500 µl Wash Buffer II。 洗涤离心 室温、12,000xg 离心 20 secs。 弃洗涤流出液 仅弃流出液，保留收集管。 重复洗涤 再进行一次 Wash Buffer II 加样、离心和弃流出液。 离心干燥 室温、12,000xg 离心 1 min，使柱膜干燥。 更换洗脱管 弃流出液和收集管，将柱放入新的 1.5 ml 管。 加入洗脱水 向柱膜中央加入 30 µl 无 RNase 水。 静置洗脱 室温静置 30 secs。 收集 RNA 室温、12,000xg 离心 2 mins；经过 DNase 处理的样品将离心时间减为 1 min。如收集管破损，将洗脱液转入新的 1.5 ml 管。 保存 RNA RNA 置 -80°C 保存；操作期间置湿冰，避免长时间留在室温。

配制 RNA 与引物混合液 在无菌离心管中加入 RNA：总 RNA 1ng-1 µg 或 poly(A) RNA 1-100 ng；引物 2 µl（50 µM dT 或 60 µM Random Primer Mix）；10 mM dNTP 混合液 1 µl。用无核酸酶水补至 12 µl。 RNA 变性 可将混合液置 65 °C - 70 °C 加热 3-5 minutes，短暂离心后立即置冰上。 配制反转录体系 加入 4 µl 5X ProtoScript II RT Reaction buffer、2 µl 0.1 M DTT、1 µl Murine RNase inhibitor（40 U/µl）和 1 µl ProtoScript II Reverse Transcriptase（200 U/µl），总体积 20 µl。 随机引物退火 使用 Random Primer Mix 时，在 42 °C 反应前，先于 25 °C 孵育 00:05:00。 反转录 42 °C 孵育 30 minutes-1 hour。 酶失活 80 °C 孵育 00:05:00。 保存 cDNA 产物置 -20 °C 保存，或进入后续检测。

检查摄像机设置 检查摄像机设置。 将 Atlantis 自动升降平台置于水池，确认升降运动正常，避免平台上下移动时产生水波 将 Atlantis 自动升降平台置于水池，确认升降运动正常，避免平台上下移动时产生水波。 将平台放置在与前一天不同的位置 将平台放置在与前一天不同的位置。 实验第一天不执行与前一天位置比较的要求 实验第一天不执行与前一天位置比较的要求。 启动 Bonsai 工作流，确认以 30 fps 记录视频 启动 Bonsai 工作流，确认以 30 fps 记录视频。 降下平台，使动物暂时无法使用平台 降下平台，使动物暂时无法使用平台。 将动物放在所选起点，面向水池中心 将动物放在所选起点，面向水池中心。 轻放动物入水，避免抛掷和溅水 轻放动物入水，避免抛掷和溅水。 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序。 经过 1 分钟 后，按下按钮升起平台 经过 1 分钟 后，按下按钮升起平台。 动物到达并接触平台时停止计时；本次试验时限为 2 分钟 Choose the matching condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less; Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 动物到达并接触平台时停止计时；本次试验时限为 2 分钟。 返回取出动物，放入笼内擦干 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 返回取出动物，放入笼内擦干。 间隔 30 分钟 后开始第 2 次试验 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 间隔 30 分钟 后开始第 2 次试验。 升起平台，使动物能够登台，但平台仍不可直接看见 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 升起平台，使动物能够登台，但平台仍不可直接看见。 将动物放在所选起点，面向水池中心；每次试验随机选择不同的起点 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 将动物放在所选起点，面向水池中心；每次试验随机选择不同的起点。 轻放动物入水，避免抛掷和溅水 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 轻放动物入水，避免抛掷和溅水。 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序。 动物到达并接触平台，或经过 1 分钟 时停止计时 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Choose the matching condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in 1 minute or less; Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 动物到达并接触平台，或经过 1 分钟 时停止计时。 返回取出动物，放入笼内擦干 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in 1 minute or less 返回取出动物，放入笼内擦干。 间隔 5 分钟 后进行下一次试验 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in 1 minute or less 间隔 5 分钟 后进行下一次试验。 将大鼠放在平台上 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 将大鼠放在平台上。 离开实验区域 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 离开实验区域。 等待 10 秒 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 等待 10 秒。 返回取出动物，放入笼内擦干并等待 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 返回取出动物，放入笼内擦干并等待。 间隔 5 分钟 后进行下一次试验 Condition: Platform — Rats will find the platform. They will do this in two minutes or less Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 1 minute 间隔 5 分钟 后进行下一次试验。 将大鼠放在平台上 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 将大鼠放在平台上。 离开实验区域 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 离开实验区域。 等待 10 秒 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 等待 10 秒。 返回取出动物，放入笼内擦干并等待 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 返回取出动物，放入笼内擦干并等待。 间隔 30 分钟 后开始第 2 次试验 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 间隔 30 分钟 后开始第 2 次试验。 升起平台，使动物能够登台，但平台仍不可直接看见 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 升起平台，使动物能够登台，但平台仍不可直接看见。 将动物放在所选起点，面向水池中心；每次试验使用不同的起点 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 将动物放在所选起点，面向水池中心；每次试验使用不同的起点。 轻放动物入水，避免抛掷和溅水 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 轻放动物入水，避免抛掷和溅水。 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 释放动物且操作者离开实验区域时，启动计时器或计算机跟踪程序。 动物到达并接触平台时停止计时；本次试验时限为 1 分钟 Condition: Not platform — If the rat does not find the platform within 2 minutes. 动物到达并接触平台时停止计时；本次试验时限为 1 分钟。