RT-qPCR 通用

方法说明

方法分类

分子生物学

技术原理

实时反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测先在逆转录酶作用下把 RNA 链反转录为其互补 DNA，再进行实时 PCR 扩增；通过对目标序列的特异性实时扩增与循环监测来推断 RNA 丰度，属于间接测量，不是对蛋白丰度的直接测定。

输入样本

RNA · tissue

可回答的研究问题

未提供

输出与判读

Cq 须先转换为经扩增效率校正的目标量，再进行内参归一化与组间倍数差异比较；扩增效率的估计与参考基因的选择直接改变归一化后的输出数值，判读时应报告适合相应分析的比较方式、测量范围与不确定度。

适用条件

适用于以 RNA 为起始材料、对目标转录本作绝对或相对定量的检测；所选参考基因的稳定性必须针对实际组织与实验条件预先验证，生物学重复与技术重复在定量判读中承担不同作用，不能相互替代。

局限

沿用未经测定的扩增效率等同假设、或仅因传统上被称为管家基因而未经稳定性验证直接选用的参考基因（如常见的 GAPDH、β-actin 默认设置），会系统性偏移归一化结果；RNA 丰度经由扩增间接推断，不能直接等同于蛋白丰度。

标准概念来源：OBI:0000911 · OBI · 2026-05-08

已发布模型

• C57BL/6J
• db/db (Lepr^db)
• ApoE⁻⁻ 动脉粥样硬化模型
• C57BL/6 MPTP 黑质纹状体变性参考模型（文献参考）
• AOM/DSS 结肠炎相关结肠肿瘤模型（文献参考）
• OVA 致敏激发过敏性气道炎症模型（文献参考）
• 脊髓挫伤损伤模型（小鼠，文献参考）
• LPS 相关急性肺部炎症模型（免疫研究参考）

已发布方案版本

• cDNA 模板的实时定量 PCR（qPCR，SYBR Green 分支）

  来源版本：protocols.io · vv1 · Miquel Vila · Creative Commons Attribution License (CC BY)

参考文献

1. real time reverse-transcription polymerase chain reaction assay (OBI:0000911), OBI 2026-05-08（定义:RNA 链经逆转录酶生成互补 DNA 后再行 PCR 检测；官方 EXACT 同义词 qRT-PCR、RRT-PCR、RT-rt PCR；定义中 RNA 为反转录底物，支持样品类型 RNA）
2. Bustin SA, et al. MIQE 2.0: Revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Guidelines. Clinical Chemistry. 2025;71(6):634-651. DOI:10.1093/clinchem/hvaf043; PMID:40272429.（PCR Efficiency、Quality Control 与 Data Analysis 节:Cq 需经效率校正后归一化与组间比较；参考基因稳定性须按实际组织与实验条件验证；原始 Cq 与未经验证的效率等同假设会引入偏倚；扩增后推断的 RNA 丰度不等同于蛋白直接测量）